龍膽和堅龍膽對照提取物的制備

玄 敏， 程雪梅，2， 王長虹，2*， 王崢濤，2

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海201203；2.上海中藥標準化研究中心，上海201203）

龍膽和堅龍膽對照提取物的制備

玄 敏1， 程雪梅1，2， 王長虹1，2*， 王崢濤1，2

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，中藥標準化教育部重點實驗室，上海201203；2.上海中藥標準化研究中心，上海201203）

目的研究龍膽與堅龍膽對照提取物的制備工藝及質(zhì)量控制方法。方法以龍膽提取物HPLC指紋圖譜中龍膽苦苷和另外4個特征峰峰面積為評價指標，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化其制備工藝，并建立龍膽和堅龍膽對照提取物指紋圖譜。結(jié)果最佳制備工藝為藥材最粗粉加10倍量水，回流提取3次，每次1 h，獲得粗提物；粗提物濃縮至含原藥材6.60 g/100 mL，加3倍量乙酸乙酯，萃取2次，萃取液蒸干，真空干燥。龍膽、堅龍膽對照提取物中龍膽苦苷平均質(zhì)量分數(shù)分別為31.37%、25.20%。龍膽對照提取物指紋圖譜標定龍膽苦苷和另外4個特征峰，整體相似度大于0.99；堅龍膽對照提取物指紋圖譜標定龍膽苦苷和另外4個特征峰，整體相似度大于0.98。結(jié)論對照提取物制備工藝穩(wěn)定，重復性好，可用于龍膽藥材、飲片的質(zhì)量控制。

龍膽；對照提取物；龍膽苦苷；HPLC指紋圖譜

龍膽為多基源藥材，2010年版 《中國藥典》收載的龍膽為龍膽科Gentianaceae龍膽屬Gentiana植物龍膽Gentiana scabra Bge.、條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag.、三花龍膽Gentiana triflora Pall或堅龍膽Gentiana rigescens Franch的干燥根和根莖，前三種習稱 “龍膽”，后一種習稱 “堅龍膽”［1］。龍膽主要產(chǎn)地為內(nèi)蒙古、東北，堅龍膽道地產(chǎn)地為云南。龍膽始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品［2］。其味苦，性寒，為清肝膽濕熱，瀉下焦郁火之常用中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，龍膽具有保肝、利膽、健胃、抗炎、抗菌及對中樞系統(tǒng)的作用［3］。龍膽主要化學成分有環(huán)烯醚萜類 （iridoids）、三萜類（triterpenes）、黃酮類（flavonoids）、口山酮類（xthantones）等［4-6］。龍膽的質(zhì)量控制主要集中在以龍膽苦苷（gentiopicroside）、當藥苷（sweroside）、當藥苦苷（swertiamarin）等環(huán)烯醚萜類成分為指標的研究［7-10］。龍膽藥材現(xiàn)行質(zhì)量標準中，以龍膽苦苷為指標進行TLC定性鑒別和HPLC定量測定。

對照提取物是中藥標準物質(zhì)的一種，其易于獲得，成本低廉，使用快捷簡便，可用于中藥材、飲片的多指標質(zhì)量控制，具有廣泛應用前景。2010年版 《中國藥典》共收載16種對照提取物，其在中藥標準物質(zhì)中所占比例很小，對中藥對照提取物進行研究具有現(xiàn)實意義［11］。龍膽中大極性成分含有量較高，中、小極性成分含有量較低［12-14］。前期研究發(fā)現(xiàn)龍膽中的中、小極性成分具有一定的鑒別意義，可用于龍膽和堅龍膽藥材的定性質(zhì)量控制。本實驗以龍膽與堅龍膽為研究對象，制備對照提取物，擬作為標準物質(zhì)快速、簡便地用于龍膽藥材、飲片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀（G1315C型四元梯度泵、G1311B型在線脫氣機、G1367E型自動進樣器、G1316A型DAD柱恒溫箱、G1330B型DAD檢測器），Agilent Chemstation色譜工作站；BT-124S電子分析天平（Sartorius公司）；GRT-RK型電熱套 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱 （上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）。

龍膽苦苷由上海中藥標準化研究中心提供（純度＞98%）；龍膽藥材購自安國藥材市場，堅龍膽藥材由蘭州佛慈制藥股份有限公司饋送，經(jīng)上海中藥標準化研究中心吳立宏研究員鑒定分別為龍膽G.scabra與堅龍膽G.rigescens的干燥根和根莖，憑證標本存放于上海中藥標準化研究中心標本室。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照提取物制備工藝 本實驗前期基于極性導向，在保留大極性成分的基礎(chǔ)上，富集龍膽和堅龍膽藥材中的中、小極性成分，可用于表征龍膽藥材的特征 （另文報道），見圖1。

圖1 龍膽和堅龍膽藥材的特征指紋圖譜Fig.1 Characteristic fingerprints of G.scabra and G. rigescens

本研究在龍膽提物制備工藝 （藥材最粗粉加10倍量水，回流提取3次，每次回流時間為1 h）［15］的基礎(chǔ)上，考察乙酸乙酯萃取法制備提取物的工藝條件。選擇粗提物質(zhì)量濃度 （A）、萃取溶劑/粗提物倍量 （體積） （B）、萃取次數(shù) （C）為考察因素，每個因素設(shè)立3個水平，通過L9（34）正交表安排試驗，以提取物指紋圖譜中的1、4、6、8、9號特征峰 （圖1A）峰面積為考察指標（權(quán)重系數(shù)分別為0.02，0.3，0.08，0.3，0.3），綜合評價和篩選龍膽對照提取物萃取工藝，試驗因素及水平見表1。

表1 試驗因素及水平Tab.1 Factors and levels

取龍膽藥材12 g，精密稱定，加10倍量水，回流提取3次，1 h/次，離心，合并藥液，定容；加乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層蒸干，70%甲醇超聲溶解，濾過，得供試品。記錄目標特征峰峰面積，計算綜合評分，結(jié)果見表2。

表2 正交試驗安排及評分結(jié)果 （n=3）Tab.2 Orthogonal experiment arrangements and scores（n=3）

直觀分析評分結(jié)果知，影響因素從大到小依次為A＞C＞B。以空白項D作為誤差項，進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析Tab.3 Table of variance analysis

方差分析結(jié)果顯示，因素A（粗提物質(zhì)量濃度）為萃取效果最主要影響因素 （P＜0.05）。結(jié)合直觀分析和實際生產(chǎn)，確定最佳工藝為A3B3C2，即粗提物質(zhì)量濃度6.60 g/100 mL，加3倍量 （體積）乙酸乙酯萃取2次。

2.2 工藝驗證 根據(jù)最佳工藝條件制備3份龍膽對照提取物樣品，計算評分，結(jié)果見表4。驗證試驗得分均較高，重復性好。

表4 驗證試驗結(jié)果Tab.4 Resu lts of verification experiments

根據(jù)篩選工藝制備堅龍膽對照提取物樣品，發(fā)現(xiàn)堅龍膽對照提取物圖譜特征性強，各特征峰峰高比例協(xié)調(diào)，所篩選工藝適用于堅龍膽對照提取物的制備。

2.3 對照提取物制備 根據(jù)最佳工藝條件分別制備6批龍膽對照提取物和6批堅龍膽對照提取物（表5），龍膽對照提取物平均得率為1.19%，堅龍膽對照提取物平均得率為1.99%。

2.4 對照提取物質(zhì)量標準研究

2.4.1 龍膽苦苷測定

2.4.1.1 色譜條件 Diamonsil C18（2）Column色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（25：75）；體積流量1.0 m l/min；檢測波長270 nm；柱溫30℃；進樣量10μL。色譜圖見圖2。

表5 龍膽和堅龍膽對照提取物得率、相似度和龍膽苦苷含有量Tab.5 Yield，sim ilarity，and gentiopicroside content of reference extracts from G.scabra and G.rigescens

圖2 龍膽苦苷測定色譜圖Fig.2 Chromatograms for gentiopicroside

2.4.1.2 對照品溶液的制備 取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.925 0 mg的貯備液。

2.4.1.3 供試品溶液的制備 取對照提取物約13 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇振搖溶解并定容至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.4.1.4 線性關(guān)系考察及標準曲線制備 分別精密吸取對照品貯備液，加甲醇稀釋成0.385～385 μg/mL的一系列對照品溶液，按“2.4.1”項譜條件測定。以峰面積 （Y）對質(zhì)量濃度 （X）進行線性回歸，得線性回歸方程Y=12.137X+4.08（r= 1.000），龍膽苦苷在0.385～385μg/mL時，峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.4.1.5 定量限、檢測限 配制龍膽苦苷對照品由高到低濃度系列溶液，按信噪比 （S：N）為3：1，計算龍膽苦苷的檢測限為0.190μg/m L，按信噪比 （S：N）為10：1，計算龍膽苦苷的定量限為0.385μg/mL。

2.4.1.6 精密度試驗 取高、中、低 （385、192.5、77μg/mL）3種質(zhì)量濃度的對照品溶液，同1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次，峰面積RSD分別為0.34%、0.82%、0.35%，日內(nèi)精密度良好；分別連續(xù)3 d進樣測試，峰面積RSD分別為1.81%、1.56%、1.29%，日間精密度度良好。

2.4.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液 （S1），分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h進樣，峰面積RSD為0.95%，樣品48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.1.8 重復性試驗 取同一批次樣品 （S1），按 “2.4.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣，龍膽苦苷RSD為1.37%，方法重復性良好。

2.4.1.9 加樣回收率試驗 采用半程加樣。取9份經(jīng)過準確定量測定的樣品13 mg，精密稱定，置25 m L量瓶中，加甲醇振搖溶解并定容至刻度，搖勻；取5mL，定容至10mL；分別按已知含有量的50%、100%、150%3個水平加入龍膽苦苷對照品。進樣檢測，計算加樣回收率，結(jié)果見表6。龍膽苦苷平均回收率為102.4%，RSD為2.7%。

表6 龍膽苦苷加樣回收率結(jié)果Tab.6 Recoveries of gentiopicroside

2.4.1.10 樣品測定 分別取6批龍膽和6批堅龍膽對照提取物樣品，按上述方法測定龍膽苦苷峰面積，按標準曲線回歸方程計算，對照提取物樣品中龍膽苦苷含有量見表5。龍膽對照提取物中龍膽苦苷平均質(zhì)量分數(shù)為31.37%，堅龍膽對照提取物中龍膽苦苷平均質(zhì)量分數(shù)為25.20%。

2.4.2 對照提取物指紋圖譜的建立 預試驗顯示，龍膽對照提取物、堅龍膽對照提取物色譜圖差異較大，故分別建立其指紋圖譜，并進行相似度分析。

2.4.2.1 指紋圖譜色譜條件 流動相為甲醇（A）-乙腈 （B）-0.1%磷酸水 （C），梯度洗脫條件見表7；檢測波長240 nm；體積流量 1.0 mL/min；柱溫30℃，進樣量10 mL。

表7 梯度洗脫條件Tab.7 Gradient elution conditions

2.4.2.2 指紋圖譜精密度 取同一供試品溶液（S1，S7），連續(xù)進樣6次，以龍膽苦苷為參照峰，計算各特征峰相對保留時間、相對峰面積，各特征峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于2%（n=6），儀器精密度良好。

2.4.2.3 指紋圖譜穩(wěn)定性 取同一供試品溶液（S1，S7），室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24、48 h進樣，各特征峰相對保留時間RSD均小于2%、相對峰面積RSD均小于4%（n=7），樣品48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.2.4 指紋圖譜重復性 取同一批次樣品（S1，S7），按 “2.4.1.3”項下方法分別平行制備6份供試品溶液，進樣檢測。各特征峰相對保留時間、相對峰面積RSD均小于2% （n=6），方法重復性良好。

2.4.2.5 指紋圖譜測定與相似度分析 取12批供試品溶液，按 “2.4.2.1”項下方法檢測，提取物中成分均可在60 min內(nèi)洗脫完畢。采用國家藥典委員會頒布的 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)” （2004A版）軟件進行相似度分析，將指紋圖譜數(shù)據(jù)導入相似度評價軟件，龍膽、堅龍膽對照提取物指紋圖譜分別以S1、S7為參照譜，采用中位數(shù)法生成對照特征圖譜，相似度分析結(jié)果見圖3。

圖3 相似度分析結(jié)果Fig.3 Results of sim ilarity analysis

龍膽、堅龍膽對照提取物各標定5個特征峰，其中1號峰龍膽苦苷為兩者共有峰。相似度數(shù)據(jù)見表5，龍膽對照提取物指紋圖譜整體相似度在0.99～1.00，堅龍膽對照提取物指紋圖譜整體相似度在0.98～0.99，各批次對照提取物相似度較高，重復性較好。

2.4.2.6 重復性考察 以龍膽苦苷為參照物峰，計算龍膽、堅龍膽對照提取物中各特征峰的相對保留時間，結(jié)果見表8。由表8知，各特征峰相對保留時間RSD均小于0.2%，表明制備工藝的重復性良好。

3 討論

龍膽為多基源藥材，2010年版 《中國藥典》收載了4種龍膽。其中龍膽和堅龍膽是目前市場流通中的主流產(chǎn)品。條葉龍膽、三花龍膽資源稀缺，本實驗僅收集到1批條葉龍膽、1批三花龍膽，樣本不足以制備提取物，有待于進一步研究。

以龍膽為研究對象，對龍膽對照提取物制備工藝參數(shù)進行了系統(tǒng)研究。前期試驗研究表明，堅龍膽指紋圖譜中的2、3、5、7號特征峰與龍膽指紋圖譜中的4、6、8、9號特征峰的紫外吸收比較相似，其中4、5號峰與6、7號峰保留時間與紫外吸收基本一致，推測其為相同類型的化合物。依據(jù)相似相容的原理，可以近似地認為堅龍膽中的小極性成分與龍膽中的小極性成分性質(zhì)類似。故采用龍膽對照提取物制備工藝制備堅龍膽對照提取物，且通過實驗結(jié)果 （圖3）證明獲得了較好的結(jié)果。

表8 6批龍膽 （S1～S6）和6批堅龍膽 （S7-S12）對照提取物特征峰相對保留時間Tab.8 Relative retention time of characteristic peaks in reference extract from G.scabra（S1～S6）and G.rigescens（S7-S12）

龍膽對照提取物平均得率較堅龍膽對照提取物低，而龍膽苦苷含有量較堅龍膽對照提取物高。兩種對照提取物指紋圖譜差異較大 （龍膽對照提取物指紋圖譜中的4、6號色譜峰分別與堅龍膽對照提取物指紋圖譜中的5、7號峰保留時間相近，紫外吸收光譜相似，但經(jīng)LC-MS法鑒定為不同成分），說明兩種藥材化學成分種類及含有量均存在顯著差異，有必要分別進行質(zhì)量控制。

致謝：樣品收集得到了蘭州佛慈制藥股份有限公司的支持，特此致謝。

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Preparation and quality control of reference extract from Gentiana scabra and Gentiana rigescens

XUAN Min1， CHENG Xue-mei1，2， WANG Chang-hong1，2*， WANG Zheng-tao1，2

（1.Institute of Chinese Material Medica，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine；The MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines，Shanghai 201203，China；2.Shanghai R&D Centre for Standardization of Chinese Medicines，Shanghai201203，China）

AIMTo establish a preparation and quality control of reference extract from Gentiana scabra and G.rigescens.METHODSGentiopicroside and four characteristic peakswere considered as the evaluation index，the preparation processwas optimized through L9（34）orthogonal experiment.HPLC fingerprints of reference extract of G.scabra and G.Rigescens were established respectively.RESULTSThe optimized preparation process was determined as follows：the coarse powdered G.scabra was reflux-extracted with tenfold water for an hour once，three times；the crude extract was concentrated to 6.60 g/100 m L，extracted with threefold ethyl acetate for 2 times，and dried in vacuum.Gentiopicroside（31.37%average content）and four characteristic peaks in reference extractof G.cabras were identified and their overall similarity wasmore than 0.99.Gentiopicroside（25.20%average content）and four characteristic peaks of reference extract from G.Rigescens were detected and their overall similarity wasmore than 0.98.CONCLUSIONThe preparation process of the reference extract from G.scabra presents a good stability and reproducibility.Therefore，it can provide a reference for the quality control of Gentianae Radix slices.

Gentianae Radix；reference extract；gentiopicroside；HPLC fingerprint

R284.2

A

1001-1528（2015）04-0746-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.012

2014-11-20

國家藥品標準提高暨2015版藥典科研任務資助 （2012）

玄 敏（1988—），女，碩士生，研究方向為藥物分析及中藥質(zhì)量標準。E-mail：dfzz-0088@163.com

*通信作者：王長虹，男，研究員，博士生導師，研究方向為中藥新制劑與體內(nèi)過程。Tel：（021）51322511，E-mail：wchcxm@ 163.com