不同溶劑對(duì)多肽類(lèi)抗原乳化效果的影響

婁永富，張雪嬌，劉嘉琳，王榮愛(ài)，劉紹川，孟明

（河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

·基礎(chǔ)研究·

不同溶劑對(duì)多肽類(lèi)抗原乳化效果的影響

婁永富，張雪嬌，劉嘉琳，王榮愛(ài)，劉紹川，孟明

（河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000）

目的探究多肽類(lèi)抗原在與弗氏完全佐劑乳化過(guò)程中不同的抗原溶劑（無(wú)菌水和PBS緩沖溶液）對(duì)乳化效果的影響。方法利用三通管連接雙注射器的人工乳化器推拉法進(jìn)行抗原乳化，采用滴水實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乳化效果。結(jié)果以無(wú)菌水作為溶劑，乳化時(shí)間較長(zhǎng)，乳化程度易于人工控制；以PBS緩沖液作為溶劑，會(huì)在極短時(shí)間即形成穩(wěn)定的“油包水”乳劑，但容易乳化過(guò)度。結(jié)論多肽類(lèi)抗原乳化過(guò)程中，不同抗原溶劑對(duì)乳化效果的影響有較大差異。

弗氏完全佐劑；多肽類(lèi)抗原；抗原溶劑；乳化效果

本文引用：婁永富,張雪嬌,劉嘉琳,等.不同溶劑對(duì)多肽類(lèi)抗原乳化效果的影響[J].醫(yī)學(xué)研究與教育,2015,32(3): 1-5.

佐劑（adjuvant）是指預(yù)先或與抗原同時(shí)注入體內(nèi)，能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原免疫應(yīng)答的非特異性免疫增強(qiáng)性物質(zhì)[1]。目前最常用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的佐劑是弗氏完全佐劑（complete Freund's adjuvant,CFA）和弗氏不完全佐劑（incomplete Freund's adjuvant,IFA）。在進(jìn)行人工免疫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，常將佐劑與抗原溶液按比例混合進(jìn)行乳化，以增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生的免疫反應(yīng)，獲得高效價(jià)抗體。CFA是Freund[2]發(fā)明的主要由礦物油、羊毛脂和卡介苗等組成的佐劑，常用于小分子可溶性抗原的乳化：通過(guò)延長(zhǎng)抗原在動(dòng)物體內(nèi)潴留時(shí)間，刺激抗原提呈細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)抗原的加工和提呈以及刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答效應(yīng)（即產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答）[3]。

本課題組在進(jìn)行類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[4]過(guò)程中，選用葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（GPI）多肽[5]片段為抗原誘導(dǎo)DBA/1小鼠制備RA模型[6-7]。為了保持多肽抗原的穩(wěn)定性、增強(qiáng)抗原的免疫原性，在免疫動(dòng)物前，需要先將水溶性抗原GPI多肽與CFA混合進(jìn)行乳化[8]，以形成穩(wěn)定的“油包水”乳劑[9]。

在乳化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，水溶性的GPI多肽抗原以無(wú)菌水溶液為介質(zhì)和以PBS緩沖液為介質(zhì)進(jìn)行抗原乳化的效果存在明顯差異。本實(shí)驗(yàn)旨在觀(guān)察和比較不同的抗原溶劑對(duì)GPI多肽與CFA乳化效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

弗氏完全佐劑：10 mL，F(xiàn)5881,購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。預(yù)冷去離子水（pH=7.0）。預(yù)冷PBS緩沖液：濃度為0.01 mol/L，pH=7.2，購(gòu)自Invitrogen (Grand Island,NY,USA)。GPI多肽（325-339和469-483兩個(gè)肽段）4 mg，合成于北京賽百盛公司。三通管 2 個(gè)、10 mL塑料注射器 4 個(gè)、1000 μL及200 μL移液器各1只、燒杯若干、冰水混合物等。

1.2 方法

1.2.1 乳化方法

采用三通管連接雙注射器的人工乳化器推注法[10（圖1）。實(shí)驗(yàn)分為兩組，同時(shí)進(jìn)行以方便比較。

無(wú)菌條件下操作，預(yù)先將CFA經(jīng)50℃加熱融化（液態(tài)油，淺黃色），備用。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別采用無(wú)菌去離子水或無(wú)菌PBS緩沖液4 mL溶解GPI多肽2 mg，制備抗原液；再將CFA與每一種抗原液按照1∶1比例，分別吸入1套人工乳化器的注射器內(nèi)（2個(gè)注射器以三通管相連，接口處要連緊）。之后每組兩個(gè)操作者面對(duì)面推拉針芯，使溶液通過(guò)三通管進(jìn)入對(duì)側(cè)注射器針管內(nèi)，每次推動(dòng)針芯時(shí)必須把針管的內(nèi)容物全部推空，另一側(cè)也同樣操作，使液體在針管內(nèi)往返混合。乳化操作應(yīng)保持勻速進(jìn)行，最佳推拉頻率為10～15 次/分。

1.2.2 檢測(cè)方法

滴水試驗(yàn)[11]:準(zhǔn)備冰水混合物置于燒杯中，用移液器從人工乳化器中吸取適量待檢樣品，滴數(shù)滴于冰水表面，觀(guān)察油滴在水面散開(kāi)的時(shí)間（需靜置觀(guān)察10 min以上）。

2 結(jié)果

油滴在10 min不散開(kāi)者提示樣品已完全乳化，形成了穩(wěn)定的油包水狀態(tài)（圖2）。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組均以時(shí)間為梯度，連續(xù)觀(guān)察和檢測(cè)不同時(shí)間段的乳化效果，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

兩種不同抗原溶劑的乳化效果顯示，以預(yù)冷的去離子水為溶劑，抗原完全乳化是個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程（圖3、圖4），所需時(shí)間較長(zhǎng)（至少25 min），乳化的程度可以人工把握，不易出現(xiàn)過(guò)度乳化。但由于乳化過(guò)程較長(zhǎng)，需要在低溫條件下操作，方可避免抗原變性。因此，抗原乳化推注過(guò)程盡可能在冰浴條件下進(jìn)行。與無(wú)菌水相比，預(yù)冷的PBS緩沖液作為抗原溶劑能夠迅速改變CFA的物理狀態(tài)（如顏色、黏稠度等），用乳化器推拉針芯2～5 min即形成油包水的乳化狀態(tài)抗原（GPI和CFA），繼續(xù)推拉則CFA很快變成乳白色稠奶油狀（圖5），操作者難以把握完全乳化的最佳時(shí)間段和推拉次數(shù)，極容易乳化過(guò)度（圖6）。

表1 樣品乳化過(guò)程中的物理狀態(tài)變化

表2 樣品乳化過(guò)程中的滴水試驗(yàn)檢測(cè)

圖1 三通管機(jī)械乳化法

圖2 乳化完全，穩(wěn)定的“油包水”狀

圖3 去離子水乳化2 min

圖4 去離子水乳化20 min

圖5 PBS緩沖液乳化15 min

圖6 PBS緩沖液乳化20 min

3 討論

佐劑的作用機(jī)制主要為：（1）改變抗原物理性狀，延緩抗原降解，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)潴留時(shí)間。（2）刺激抗原提呈細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)抗原的加工和提呈。（3）刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化，增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答效應(yīng)[12]。本實(shí)驗(yàn)中使用的CFA作為佐劑的一種，其中，石蠟油因不能被機(jī)體代謝而使乳劑潴留在注射的部位，大大阻礙了抗原降解速度，使抗原能夠緩慢地釋放，持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；羊毛脂對(duì)水溶性抗原與油形成穩(wěn)定的乳劑具有重要促進(jìn)作用；滅活的結(jié)核分枝桿菌可以非特異性的激活免疫系統(tǒng)（包括體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答）[13-15]。

作為疫苗制備的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抗原乳化是將佐劑與抗原溶液按比例混合，制備成 “油包水”乳劑的過(guò)程[16]，其作用機(jī)制是在有油和水的混合物中加入乳化劑（本實(shí)驗(yàn)為羊毛脂）后，進(jìn)行機(jī)械混合，一方面，乳化劑的親水基結(jié)合水，親油基結(jié)合油，使油-水兩相之間形成一層致密的介面膜，降低了油與水之間的接口張力形成小液滴，同時(shí)對(duì)液滴起保護(hù)作用；另一方面，由于乳化過(guò)程中吸附和摩擦等作用使得液滴表面帶電，帶電液滴在接口的兩側(cè)會(huì)形成雙電層結(jié)構(gòu)，其排斥作用使得小液滴難以聚集，從而提高了乳化液的穩(wěn)定性[17-18]。理想的乳化能增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，提高免疫抗原的保護(hù)效果[19]。因此，乳化過(guò)程十分重要，而佐劑、抗原溶劑、時(shí)間、溫度、乳化器及操作技巧等每個(gè)環(huán)節(jié)的變化，都會(huì)影響乳化效果。

目前已有報(bào)道[20]，去離子水和PBS緩沖液都可以作為抗原乳化的溶劑，且在乳化過(guò)程中不改變抗原的結(jié)構(gòu)和免疫原性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以去離子水為溶劑進(jìn)行GPI多肽抗原和CFA乳化，是一個(gè)緩慢而溫和的過(guò)程，乳化時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，便于人工控制，但冰浴乳化操作較繁瑣。以PBS緩沖液為溶劑進(jìn)行乳化，則是一個(gè)快速的過(guò)程，乳化完成時(shí)間較短（2～5 min），容易乳化過(guò)度，難以人工控制。這可能是由于PBS緩沖液中的磷酸根基團(tuán)[21-24]之間的靜電斥力作用，增強(qiáng)了乳化液的穩(wěn)定性[25],從而加速了完全乳化的過(guò)程。如果繼續(xù)乳化（時(shí)間較短），PBS緩沖液中Na+、K+離子與磷酸根基團(tuán)充分接觸，壓縮雙電層，使其厚度變薄，乳狀液的穩(wěn)定遭到破壞，小液滴聚集，乳劑粘度增加，導(dǎo)致乳化過(guò)度[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，若在可控制乳化程度的前提下加快乳化速度，可以嘗試用無(wú)菌水為主要溶劑，添加少量或低濃度的PBS 緩沖液作為輔助溶劑。至于無(wú)菌水與添加PBS緩沖液的比例和條件，還需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行摸索。

此外，乳化器的材質(zhì)和乳化過(guò)程的溫度也很重要。如果選用一次性塑料注射器，因其封閉良好、不易漏液更適用于少量的或昂貴的抗原乳化，但其摩擦阻力較大，乳化時(shí)間越長(zhǎng)越難推動(dòng)；有時(shí)還可能因?yàn)闃悠妨看螅榛瘯r(shí)間長(zhǎng)出現(xiàn)掉色現(xiàn)象，使溶液變黑，影響實(shí)驗(yàn)效果。玻璃注射器克服了塑料的材質(zhì)問(wèn)題，且磨砂針芯有利于抗原乳化，但不足是玻璃注射器易漏，容易造成抗原的浪費(fèi)。此外，低溫條件雖然使乳化速度變慢，卻能防止抗原變性，所以用注射器推拉乳化抗原的操作要在冰浴條件下進(jìn)行。

綜上所述，抗原乳化過(guò)程中，需要綜合考慮抗原溶劑、乳化程度的可控性、乳化器材質(zhì)、環(huán)境溫度等綜合因素，方能得到最佳的乳化效果：既保持抗原的穩(wěn)定性，又延長(zhǎng)抗原在動(dòng)物體內(nèi)的時(shí)間，提高免疫原性，成功造模。

[1]劉洋,曹雪濤.免疫佐劑研發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志,2014,21(2): 192-202.

[2]FREUND J.The mode of action of immunologica1 adjuvants[J].Adv Tuberc Res,1956,7 (10): 130-148.

[3]霍華德 G C,凱瑟 M R.抗體制備與使用實(shí)驗(yàn)指南[M].張權(quán)庚,張玉詳,譯.北京: 科學(xué)出版社,2010: 20-25.

[4]孟明,周蕾,高偉敏,等.活化血小板對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥和增生影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(8): 828-833.

[5]王黎醒,李小峰,趙向聰,等.血清葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2013,11(16): 631-633.

[6]IWANAMI K,MATSUMOTO I,TANAKA-WATANABE Y,et al.Crucial role of the interleukin-6/interleukin-17 cytokine axis in the induction of arthritis by glucose-6-phosphate isomerase[J].Arthritis Rheum,2008,58(3): 754-763．

[7]MATSUMOTO I,ZHANG H,YASUKOCHI T,et al.Therapeutic effects of antibodies to tumor necrosis factor-alpha,interleukin-6 and cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 immunoglobulin in mice with glucose-6-phosphate isomerase induced arthritis[J].Arthritis Res Ther,2008,10(3): R66.

[8]IWANAMI K,MATSUMOTO I,TANAKA Y,et al.Arthritogenic T cell epitope in glucose-6-phosphate isomerase-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther,2008,10(6): R130．

[9]FERNANDEZ P,PETRES S,MECHERI S,et al.Strain-transcendent immune to recombinant Var2CSA DBL5-domain block P.falciparum adhesion to placenta-derived BeWo cells under flow conditions [J].PLoS One,2010,5(9): e12558.

[10]黃小榮,梁昌盛,駱曉楓,等.抗原-弗氏佐劑乳化實(shí)驗(yàn)技術(shù)的改進(jìn)與技巧[J].實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2013,32(8): 265-285.

[11]羅波,毛櫻逾,段素群,等.弗氏佐劑與抗原乳化方法的改良及其應(yīng)用[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2012,39(5): 1200-1206.

[12]徐鳳宇,何昭陽(yáng).免疫佐劑的作用機(jī)制及其應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(5): 449-455.

[13]周莉婷,趙晶晶,吳彥卓,等.分枝桿菌多糖免疫調(diào)節(jié)劑研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2011,18(2): 176-179.

[14]李瑤瑤,明恒強(qiáng).我國(guó)免疫佐劑的研究現(xiàn)狀[J].獸藥與飼料添加劑,2009,14(5): 11-14.

[15]李學(xué)釗,洪場(chǎng),王治倉(cāng),等.免疫佐劑研究進(jìn)展及前景展望[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2014,22(4): 81-86.

[16]DONAYRE-TORRES A J,ESQUIVEL-SOTO E,GUTIE RREZ-XICOTE NCATL MDE L,et al.Production and purification of immunologically active core protein p24 from HIV-1 fused to ricin toxin B subunit in E.coli[J].Virol J,2009,6: 17.

[17]韓霞,程新皓,王江,等.陰陽(yáng)離子表面活性劑體系超低油水界面張力的應(yīng)用[J].物理化學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(1): 146-153.

[18]譚文英,許勇,王述洋,等.乳化劑及助乳化劑提高生物油/柴油乳化性能[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2013,29(24): 235-242.

[19]LOUDON PT,YAQER EJ,LYNCH DT,et al.GM-C SF increases mucosal and systemic immunogenicity of an H1N1 influenza DNA vaccine administered into the epideim is of non-human primates [J].PLoS One,2010,5(6): e11021.

[20]牛鳳云,陳會(huì)娟,賈維剛,等.肌力康飲對(duì)EAMG大鼠血清AchR-Ab及TGF-B1水平的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2010,28(1): 80-82.

[21]錢(qián)毅玲,趙謀明,趙強(qiáng)忠.卡拉膠/黃原膠和K+濃度對(duì)低脂低鹽乳化腸凝膠品質(zhì)影響的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(7): 734-737.

[22]徐小剛,杜鵑,羅艷,等.乙烯基聚硅氧烷低聚物乳液的制備及應(yīng)用[J].印染助劑,2013,30 (6): 18-22.

[23]宋儒坤,李斌,許沙沙,等.卵黃高磷蛋白的功能與應(yīng)用研究[J].中國(guó)家禽,2011,33(16): 40-42.

[24]鄭配國(guó),馬雪涵,張俊華,等.CDllb 在小鼠脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞中的差異表達(dá)及其功能[J].細(xì)胞與分子兔疫學(xué)雜志,2014,30(12): 1271-1273.

[25]馬杰,張士璀.卵黃蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[J].魯東大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,2012,28(3): 252-260.

[26]張付軒,張戰(zhàn)修.影響乳化的因素[J].中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2011,9(3): 185-186.

（責(zé)任編輯：劉俊華）

Effects of different solvents on the polypeptide antigen’s emulsifcation

LOU Yongfu,ZHANG Xuejiao,LIU Jialin,WANG Rongai,LIU Shaochuan,MENG Ming
(College of Basic Medical Science of Hebei University,Baoding 071000,China)

ObjectiveTo study the effects of different solvents (sterile water and PBS buffer) on the polypeptide antigen’s emulsification.MethodsDissolved polypeptide antigen was completely emulsified with complete Freund’s adjuvant by the way of pull-and-push with an artificial blender connecting three-way pipe and two syringes.The effects of emulsified mixture were evaluated by water drip test.ResultsThe emulsification time was longer and the procedure was easy to control by taking the sterile water as solvent.The stable water in oil emulsifier was formed in a short time by taking the PBS buffer as solvent,whereas it was easy to get over emulsifed.ConclusionThe effects of different solvents on the polypeptide antigen’s emulsifcation were different signifcantly.

complete Freund's adjuvant; polypeptide antigen; antigen solvent; emulsion affection

10.3969/j.issn.1674-490X.2015.03.001

R392

A

1674-490X(2015)03-0001-05

2015-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373197）；河北省自然科學(xué)基金（H2014201133）；河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)基金（2014A1001、2014A1002）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2014099）

婁永富（1992—），男，滿(mǎn)族，河北承德人。

孟明（1964—），女，遼寧義縣人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事自身免疫病及免疫藥理學(xué)研究。

E-mail: mengming127@163.com