細胞外基質(zhì)對哮喘模型大鼠氣道平滑肌細胞免疫調(diào)節(jié)作用

陳忠仁 梁梅蘭

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥疾病，由多種細胞和細胞組分參與。作為維持氣道結(jié)構(gòu)和功能重要成分的氣道平滑肌細胞(airway smooth muscle cell，ASMCs)和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，在哮喘的疾病發(fā)生、發(fā)展 中 起了重要的作用［1，2］。ASMCs 在炎性反應(yīng)中作用比較活躍，能夠分泌多種炎性介質(zhì)，產(chǎn)生一系列細胞因子，表達免疫細胞的黏附分子以及包括Fas 在內(nèi)的一些細胞表面分子標志物，ASMCs 所分泌的這些因子能夠促進ASMCs 自身的增殖［3～5］。ASMCs 還能夠產(chǎn)生細胞外基質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶和相關(guān)的抑制劑，促進有絲分裂的發(fā)生，是引起支氣管哮喘氣道狹窄的重要病理因素，如Ⅰ型膠原(type Ⅰcollagen，COL -1)、層黏蛋白(laminin，LA)等有顯著增加，兩者可相互影響。為了探討這一問題，本實驗將大鼠ASMCs 種植于用涂覆有ECM 的培養(yǎng)瓶中，采用Western blot 法檢測哮喘ASMCs eotaxin、TGF-β1 蛋白的表達，探討ECM 對哮喘大鼠ASMCs 免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

材料與方法

1.材料:健康Wistar 雄性大鼠。卵清蛋白(ovalbumin，OVA)﹑COL-1、LA、胎牛血清(fetus bovine serum，F(xiàn)BS)、木瓜蛋白酶﹑Ⅰ型膠原酶﹑牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購于美國Sigma 公司。小鼠抗肌動蛋白(α -actin)和Trizol 溶液購自美國GIBCO 公司。單去污劑裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10%分離膠、4%濃縮膠、0.15mol/L NaCl 溶液、2 ×(5 ×)SDS 上樣緩沖液、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10 ×麗春紅染液、封閉液、TBST、TBS、洗脫抗體緩沖液、抗體、化學發(fā)光試劑。

2.大鼠哮喘模型的建立及分組:(1)哮喘模型的建立:參照文獻［7］中的方法，在大鼠后腿內(nèi)側(cè)皮下注射1ml 體積的0.9%生理鹽水混合液(含有10mg 的OVA 以及200mg 的氫氧化鋁);注射后第8 天重復(fù)上述步驟;注射第15 天玻璃容器中進行含有2%OVA 生理鹽水的噴霧試驗，對大鼠進行噴霧處理，每次噴霧量控制在50ml，每周噴霧3 次，每次30min，共進行15 天。當大鼠出現(xiàn)躁狂、嗆咳、呼吸急促癥狀時，即哮喘模型制備成功。(2)大鼠分組:16 只大鼠隨機分為兩組，每組8只。哮喘組，利用OVA 制備模型;對照組，生理鹽水替代OVA。

3.大鼠氣道平滑肌細胞(ASMCs)的培養(yǎng)、鑒定和分組:(1)大鼠ASMCs 的培養(yǎng):根據(jù)文獻［8］報道的方法分離大鼠肺葉支氣管的ASMCs。在OVA 或生理鹽水激發(fā)2 周后，在第24h 進行麻醉取材。取肺后移入超凈臺，置于冰盒上。倒入已加雙抗的D-HANKS 液，清洗肺部。清洗后的肺組織切成1～2mm 的組織塊，將其置于消化液(含1mg/mlⅠ型膠原酶、1mg/ml 木瓜蛋白酶、10mg/mlBSA 的D -HANKS 液)中，37℃消化15min。消化完畢后，加入無血清的DMEM 培養(yǎng)基，980r/min，離心10min。棄上清，加入約1ml 含20%FBS 的DMEM。移入細胞瓶中，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，每隔3 天換液1 次，大約1 周時間，當細胞長滿單層后，胰酶消化傳代培養(yǎng)。實驗所用的細胞培養(yǎng)至第2 ～5 代。ASMCs 的鑒定主要在顯微鏡觀察細胞形態(tài)，并通過α-actin 進行細胞免疫熒光染色。

4.培養(yǎng)瓶的處理:根據(jù)參考文獻［9］報道的方法，取無菌細胞培養(yǎng)瓶(50ml)，將同一濃度的COL -1 以及LA(10μg/ml)加入細胞瓶中，加入的體積覆蓋瓶底即可，搖勻后放于37℃孵箱過夜培養(yǎng)。取出后無菌條件下加入0.1%的BSA 封閉，室溫作用30min，棄掉液體，無血清DMEM 培養(yǎng)液清洗瓶底，吸干液體，再自然風干，可直接使用，或封好瓶口待用。

5.ASMCs 分組:分離培養(yǎng)得到兩組大鼠的ASMCs，隨機分為3 組。①空白組:細胞正常培養(yǎng);②COL-1 組:將ASMCs傳代接種在包被有COL -1(10μg/ml)的細胞瓶中;③LA 組:將ASMCs 傳代接種在包被有LA(10μg/ml)的細胞瓶中。每組各3 瓶。

6. Western blot 法檢測ASMCs 中eotaxin、TGF -β1 蛋白的表達:參照Santa Cruz 公司提供的蛋白提取方法，應(yīng)用蛋白裂解緩沖液分別裂解細胞得到總蛋白。以牛血清蛋白作為標準品，繪制標準曲線，計算提取液的蛋白濃度。取總蛋白50μg，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗的工作濃度1∶500，β -actin 作為內(nèi)參照，封閉孵育二抗，工作濃度1∶1000。用ECL 化學發(fā)光試劑盒檢測雜交信號。

7.統(tǒng)計學方法:采用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(±s)表示，進行方差分析和q 檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.大鼠ASMCs 鑒定:如圖1 所示，通過細胞形態(tài)及免疫熒光染色顯示，分離得到的細胞形態(tài)長梭型，與平滑肌細胞形態(tài)形似，并且α -actin 的表達為陽性，可以判定培養(yǎng)的細胞為大鼠平滑肌細胞。

圖1 氣道平滑肌細胞α-actin DAB 染色陽性(SP，×400)

2.Western blot 法檢測eotaxin、TGF -β1 蛋白的表達:如圖2、圖3 所示，通過分析每組條帶的灰度值，對蛋白含量進行計算比較。從表1、圖2、圖3 中可看出，eotaxin、TGF-β1 蛋白在各組皆有表達，并且表達量各有不同:在哮喘模型組當中，哮喘干預(yù)組顯著高于空白組，空白組含量顯著高于正常對照組(P＜0.05);在正常對照組中，表達差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

表1 大鼠氣道平滑肌細胞eotaxin、TGF-β1 的表達含量(±s)

表1 大鼠氣道平滑肌細胞eotaxin、TGF-β1 的表達含量(±s)

與哮喘空白組相比，#P ＜0.05;與正常對照組相比，* P ＜0.05

組別 eotaxin TGF-β1哮喘LA 39182 ±62# 37165 ±53#哮喘COL-1 42663 ±41# 32465 ±37#哮喘空白 38633 ±56* 31888 ±82*正常LA 16656 ±61 16583 ±47正常COL-1 16575 ±47 16578 ±52正常對照16525 ±58 16590 ±49

圖2 eotaxin 蛋白電泳圖

圖3 TGF-β1 蛋白電泳圖

討 論

支氣管哮喘是一種氣道慢性非特異性炎癥疾病，但隨著疾病的進展，可出現(xiàn)氣道重塑，這與ASMCs 的功能狀況密切相關(guān)。ASMCs 是炎性因子的作用靶點，同時也可分泌多種細胞因子和免疫活性蛋白［10］。氣道平滑肌細胞有兩種表型:①以收縮功能為主的收縮型;②能合成、分泌及表達多種活性物質(zhì)的合成型［11］。合成型氣道平滑肌細胞可以旁分泌、自分泌等方式分泌多種活性物質(zhì)參與支氣管哮喘的病理、生理過程，啟動和維持哮喘氣道高反應(yīng)，引起慢性炎癥和氣道重塑。以往觀點認為，ASMCs 在哮喘發(fā)病過程中，在神經(jīng)源性信號和炎性介質(zhì)調(diào)控下，參與氣管收縮和舒張的過程。隨著不斷地深入研究發(fā)現(xiàn)，ASMCs 不僅可以調(diào)節(jié)支氣管的收縮和舒張，而且可分泌及表達多種免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，參與氣道慢性炎癥和氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展。近年來發(fā)現(xiàn)ASMCs 有新的生物學功能，如向黏膜層遷移使平滑肌層增厚、合成及炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)功能及動力學異常等。ASMCs 與ECM 由于其組織結(jié)構(gòu)特點，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中存在著緊密聯(lián)系，它們相互作用，發(fā)揮其功能特點，以減少對支氣管的不利影響。ASMCs 可分泌多種基質(zhì)蛋白，減緩ECM 的降解，加速氣道重建。受影響的ECM 又可調(diào)控ASMCs 的生存、增殖和遷移等生物學行為。研究表明，哮喘ASMCs 可分泌蛋白多糖、? 型膠原、硫酸軟骨素，使ECM 含量增加，這種作用不能被激素所抑制，并可分泌TIMP -1 和TIMP -2，抑制ECM 降解［12～14，15］。不同種類和數(shù)量的ECM 可影響ASMCs 的遷移速度、增殖效率、生存時間和上調(diào)平滑肌細胞的分泌功能，如FN 呈劑量依賴性促進ASMCs的增殖，種植于COL -1 和LA 的ASMCs 凋亡率下降［16］。目前還沒有研究發(fā)現(xiàn)ECM 在ASMCs 免疫反應(yīng)方面是否具有調(diào)節(jié)作用，以及怎樣參與信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

在筆者的實驗研究中，將eotaxin 及TGF -β1 作為探討ASMCs 免疫功能的重要因素。嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)最早是在嗜酸性粒細胞浸潤的支氣管肺泡灌洗液中發(fā)現(xiàn)的，在人的多種組織中都能夠檢測到eotaxin mRNA 的表達，可由不同來源的細胞產(chǎn)生［17］。支氣管哮喘的典型病理特征即嗜酸性粒細胞廣泛浸潤，而eotaxin 對嗜酸性粒細胞具有趨化作用，使其靶向遷移至炎性反應(yīng)部位，加劇哮喘的炎性反應(yīng)。同時，研究表明，eotaxin 也會影響ASMCs 在炎性反應(yīng)時的遷移方向［18］。TGF -β 生物學主要功能與炎性反應(yīng)相關(guān)，是一些炎性細胞的趨化劑，可由肺部多種免疫相關(guān)的細胞分泌;同時可以促進ECM 的表達并抑制其分解，對平滑肌細胞的增殖具有顯著作用，并通過多種通路調(diào)控哮喘的疾病過程，氣道平滑肌細胞可以分泌TGF -β［19，20］?；谶@兩種蛋白在免疫調(diào)節(jié)方面的功能，筆者將其作為研究ASMCs 的重要指標。

總之，本實驗結(jié)果顯示，ECM 對ASMCs 中eotaxin，TGF-β1 的表達有正調(diào)控作用，對哮喘氣道平滑肌細胞的作用更為顯著，這為今后防治哮喘提供了一個新的思路和方法。但ECM 通過何種途徑調(diào)節(jié)哮喘ASMCs 的免疫功能還不是很清楚，這需要進行進一步研究。

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