心肌梗死對(duì)C57BL/6J 小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)日節(jié)律的影響

周 嵐 曹濟(jì)民

在自然界中，從單個(gè)細(xì)胞到高等動(dòng)植物，以及人類的所有生命活動(dòng)均存在著按照一定時(shí)間順序規(guī)律運(yùn)行的周期性(節(jié)律性)的生命活動(dòng)現(xiàn)象，稱為生物節(jié)律，其中最重要的生物節(jié)律是晝夜節(jié)律。心血管系統(tǒng)的活動(dòng)也存在明顯的晝夜節(jié)律。已知血壓、心率、心排出量等心血管活動(dòng)指標(biāo)均存在晝夜節(jié)律，一些致命心血管事件，如心肌梗死、心源性猝死的發(fā)生也呈現(xiàn)出發(fā)病的晝夜時(shí)間傾向［1～3］。心血管系統(tǒng)自身細(xì)胞內(nèi)的分子鐘可以使其對(duì)外界的神經(jīng)體液刺激產(chǎn)生及時(shí)恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。這種分子鐘節(jié)律振蕩的衰減會(huì)影響心血管對(duì)外界環(huán)境刺激及時(shí)有效的反應(yīng)，從而影響一些心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。同時(shí)，在各種心血管疾病模型中也發(fā)現(xiàn)了晝夜節(jié)律的改變。例如，在壓力負(fù)荷增加導(dǎo)致的心肌肥大時(shí)會(huì)出現(xiàn)dbp、hlf、tef、pdk4、ucp3 基因表達(dá)節(jié)律的衰減［4］。在高鹽飲食引起的高血壓模型中，肥大心肌內(nèi)鐘基因的振蕩明顯衰減［5］，而在自發(fā)性高血壓模型中卻發(fā)現(xiàn)鐘基因的振蕩的增強(qiáng)［6］。在糖尿病性心臟病中發(fā)現(xiàn)鐘基因的雙向節(jié)律出現(xiàn)明顯相移［7，8］。但心肌梗死對(duì)晝夜節(jié)律的影響目前研究較少。本研究旨在觀察C57BL/6J小鼠心肌梗死對(duì)跑輪運(yùn)動(dòng)晝夜節(jié)律的影響。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象:C57BL/6J 小鼠，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究中心提供。

2.方法:(1)轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物準(zhǔn)備:轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)需要一間配備空調(diào)、有遮光暗室功能的專用實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)除進(jìn)出門外，所有窗體都完全密閉不透光，室內(nèi)配備紅光燈。內(nèi)置密閉、通風(fēng)、完全光控，可分別容納轉(zhuǎn)輪裝置的小室。C57BL/6J 小鼠體重一般為22 ～26g。每只小鼠分別飼養(yǎng)在裝有轉(zhuǎn)輪(直徑11.5 cm)的塑料小籠(45cm×25cm×20cm)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)初首先給予12h 光照、12h 黑暗［light (L)∶dark (D)=12∶12］光照周期至少1 周，當(dāng)小鼠完全適應(yīng)環(huán)境以及運(yùn)動(dòng)節(jié)律趨于穩(wěn)定后，再改為完全黑暗(DD)的環(huán)境記錄。當(dāng)動(dòng)物處于DD 環(huán)境時(shí)，SCN 內(nèi)鐘基因仍能產(chǎn)生晝夜節(jié)律振蕩，維持機(jī)體晝夜節(jié)律行為的穩(wěn)定存在。在DD 環(huán)境下表現(xiàn)白天行為(如夜行動(dòng)物小鼠的睡眠時(shí)段)的時(shí)間段稱為主觀白天(subjective day);而表現(xiàn)黑夜行為(如小鼠的清醒狀態(tài)和轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng))的時(shí)間段稱為主觀黑夜(subjective night)。在這種環(huán)境下記錄的時(shí)間稱為CT(circadian time)時(shí)間。通常1 個(gè)晝夜周期為24h，規(guī)定CT0(也即CT24)代表白天的開始(相當(dāng)于早晨6:00);CT6 代表正午時(shí)分(12:00);CT12 代表傍晚時(shí)分(18:00);CT18 代表午夜(24:00)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都供給足量的常規(guī)食物和水，定期清潔籠內(nèi)糞便。(2)動(dòng)物分組及心肌壞死模型建立:動(dòng)物分為兩組，分別是心肌梗死組(n=5)和假手術(shù)組(n=5)。采用經(jīng)腹腔橫膈膜液氮冷凍致局部心肌壞死的方法模擬小鼠心肌梗死［9］。用1%戊巴比妥鈉［0.1 毫升/(10 克·體重)］腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下做正中約1cm 長(zhǎng)切口，伸入5ml 注射器套管，輕輕撥開肝左葉，暴露橫膈膜，此時(shí)可見心臟搏動(dòng)。套管頭部輕壓在橫膈膜上，將液氮充分預(yù)冷的鋁棒(鋁棒由有色金屬研究院提供，長(zhǎng)10cm，直徑0.6cm，心臟接觸面呈45°并打磨光滑)。通過套管，接觸橫膈膜波動(dòng)最明顯處(心尖部)，輕輕施壓持續(xù)10s。然后關(guān)腹。假手術(shù)組只開腹，不做液氮損傷。術(shù)后每日標(biāo)準(zhǔn)飲食和飲水。術(shù)后腹腔注射青霉素25000 單位/(30 克·體重)，以預(yù)防感染。(3)小鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律監(jiān)測(cè):采用Vitalview 動(dòng)物行為節(jié)律記錄儀，配備Actiview 節(jié)律數(shù)據(jù)分析軟件。這些設(shè)備購(gòu)于美國(guó)Mini Mitter 公司。C57BL/6 小鼠從LD 光制轉(zhuǎn)入DD 光制1 周后，根據(jù)每只小鼠自身的晝夜時(shí)間(CT)，規(guī)定以小鼠開始運(yùn)動(dòng)為CT12，手術(shù)在CT6 進(jìn)行，首先在紅光燈下將小鼠取出，麻醉后用紅布遮掩雙眼，打開手術(shù)燈給小鼠實(shí)施心肌梗死手術(shù)，術(shù)后在紅光燈下重新將小鼠放回籠內(nèi)繼續(xù)記錄1 周。

結(jié) 果

1.HE 染色鑒定局部心肌壞死:本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)腹腔橫膈膜液氮冷凍致局部心肌壞死的方法模擬小鼠心肌梗死。手術(shù)后10 天取出心臟，在左心室的前下部可發(fā)現(xiàn)瘢痕形成，壁很薄，向內(nèi)塌陷，顯然已經(jīng)發(fā)生纖維化。HE 染色發(fā)現(xiàn)心肌壞死部位主要位于左心室前下壁外層心肌(圖1)，心肌壞死面積約占整個(gè)心室面積的8% ～10%。

圖1 HE 染色顯示小鼠液氮冷凍致心肌壞死(×20)

2.小鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果:筆者用Actiview 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)小鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，每5min 記錄1 次數(shù)據(jù)。圖2A 為1 只小鼠心肌梗死前后跑輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律的代表性原始記錄圖。正常情況下C57BL/6J 小鼠在DD 環(huán)境下表現(xiàn)出自身內(nèi)源性節(jié)律振蕩，其內(nèi)源性振蕩節(jié)律＜24h，因此表現(xiàn)為每天運(yùn)動(dòng)開始時(shí)間前移，而且每只小鼠在沒有外界干預(yù)的情況下運(yùn)動(dòng)周期是恒定不變的。圖2A 中的黑色實(shí)線代表記錄小鼠的恒定內(nèi)源性周期。小鼠心肌梗死后，繼續(xù)記錄小鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律，發(fā)現(xiàn)每天運(yùn)動(dòng)開始時(shí)間比心肌梗死前提前，圖2A 中的虛線即代表了小鼠心肌梗死后的內(nèi)源性周期。同時(shí)筆者通過Actiview 數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)該只小鼠心肌梗死前后1周的轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)周期進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)心肌梗死前運(yùn)動(dòng)周期為23.82h，心肌梗死后為23.42h(圖2 中B、C)，也即該小鼠的內(nèi)源性運(yùn)動(dòng)周期縮短了0. 4h，即24min。而假手術(shù)組的1 只代表性小鼠的轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)在手術(shù)前、后未發(fā)生改變(圖2 中D、E、F)。

圖2 心肌梗死對(duì)C57BL/6J 小鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律的影響

3.小鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律統(tǒng)計(jì)結(jié)果:對(duì)各組所有小鼠心肌梗死前后1 周的運(yùn)動(dòng)周期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，在DD 環(huán)境下，心肌梗死前C57BL/6J 小鼠的轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)周期為23.76 ±0.21h，心肌梗死后小鼠的轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)周期為23.21 ±0.15h，心肌梗死后運(yùn)動(dòng)周期平均縮短0.55 ±0.19h(圖3)。運(yùn)動(dòng)活性下降不明顯。而假手術(shù)組小鼠的轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)周期始終未發(fā)生改變，其平均周期為23.68 ±0.18h。

圖3 心肌梗死前后C57BL/6J 小鼠轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)周期統(tǒng)計(jì)圖

討 論

生物鐘可從不同途徑影響心血管活動(dòng)的晝夜節(jié)律。通過逆行性偽狂犬病毒示蹤技術(shù)證明，SCN 與心臟之間存在自主神經(jīng)的多突觸聯(lián)系，說(shuō)明中樞鐘可以通過直接的神經(jīng)聯(lián)系調(diào)節(jié)心臟功能［10］。心血管系統(tǒng)自身鐘基因則對(duì)環(huán)境的周期性刺激作出提前反應(yīng)，使機(jī)體準(zhǔn)確迅速地對(duì)外界變化作出反應(yīng)，例如在機(jī)體覺醒之前，交感神經(jīng)活性已經(jīng)增加。因此中樞鐘和外周鐘通過相互整合來(lái)共同調(diào)節(jié)心血管功能節(jié)律性變化。

人們對(duì)心血管事件的晝夜節(jié)律已做了較詳盡的研究。心肌梗死和心源性猝死在凌晨的幾小時(shí)內(nèi)發(fā)生率最高。而且心血管事件發(fā)生的時(shí)辰也會(huì)影響疾病的預(yù)后，例如在夜間發(fā)生心肌梗死的患者導(dǎo)致心力衰竭的危險(xiǎn)性很高，而早晨發(fā)病的患者很少發(fā)生心力衰竭。Alibhai 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死小鼠如果同時(shí)伴隨急性的晝夜節(jié)律紊亂，則心肌重塑能力減弱，其長(zhǎng)期的結(jié)構(gòu)和功能都將受到影響。說(shuō)明晝夜節(jié)律改變對(duì)心臟功能影響很大。另?yè)?jù)報(bào)道，表現(xiàn)S -T 段抬高的心肌梗死患者，心肌的晝夜功能差別出現(xiàn)了改變，說(shuō)明心臟內(nèi)源性的鐘機(jī)制被破壞［12］。

當(dāng)急性心血管事件發(fā)生后，除了心肌的晝夜節(jié)律遭到破壞外，該事件是否還會(huì)影響中樞SCN 的晝夜節(jié)律呢?本研究發(fā)現(xiàn)，在DD 環(huán)境下C57BL/6J 小鼠心肌梗死后，每天比正常情況下提前出現(xiàn)跑輪運(yùn)動(dòng)，提示提前進(jìn)入覺醒狀態(tài)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)其轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)周期平均縮短0.55 ±0.19h。一般來(lái)說(shuō)，晝夜周期的改變往往是由于中樞SCN 內(nèi)鐘基因的表達(dá)節(jié)律出現(xiàn)了重調(diào)。小鼠心肌梗死后，心率、血壓都會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的改變，筆者認(rèn)為這種急性心肌壞死破壞了心臟內(nèi)源性的鐘機(jī)制，并通過某種途徑改變了中樞SCN 內(nèi)鐘基因的振蕩節(jié)律，使SCN 內(nèi)源性鐘機(jī)制發(fā)生重調(diào)。而SCN 的節(jié)律振蕩一旦發(fā)生改變，不僅會(huì)改變運(yùn)動(dòng)周期，還可能改變受SCN 調(diào)控的自主神經(jīng)的功能活性、激素的分泌及身體其他器官的功能，同時(shí)影響疾病的預(yù)后。

Boudreau 等［13］曾報(bào)道心率的節(jié)律發(fā)生改變會(huì)影響與覺醒相伴隨的交感迷走效應(yīng)，從而增加清晨覺醒時(shí)急性心血管事件的發(fā)生頻率。在筆者的實(shí)驗(yàn)中，心肌梗死導(dǎo)致小鼠跑輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律改變，由于跑輪運(yùn)動(dòng)節(jié)律的改變直接反應(yīng)了睡眠-覺醒節(jié)律的變化，勢(shì)必會(huì)引起自主神經(jīng)的晝夜活性改變，從而影響疾病的轉(zhuǎn)歸。另?yè)?jù)報(bào)道心肌梗死會(huì)降低褪黑素的分泌，由于褪黑素的分泌存在明顯的晝夜節(jié)律性且有心臟保護(hù)作用，因此褪黑素分泌節(jié)律改變也會(huì)影響心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展［14］。所以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，筆者將從自主神經(jīng)活性、褪黑素等激素分泌等多方面探討心肌梗死通過怎樣的神經(jīng)體液機(jī)制調(diào)控SCN 節(jié)律，SCN 自身鐘蛋白的節(jié)律振蕩發(fā)生了怎樣的變化。從時(shí)間生物學(xué)的角度尋找心肌梗死的治療手段。靶向調(diào)整晝夜鐘節(jié)律、使之正?；赡艹蔀槲磥?lái)心血管疾病的治療策略之一。

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