超深低溫冷凍與碳化二亞胺交聯(lián)的同種異體肌腱修復(fù)兔跟腱損傷的實(shí)驗(yàn)研究

方 波 慈 元 宗 剛

大連市第二人民醫(yī)院，遼寧大連 116000

超深低溫冷凍與碳化二亞胺交聯(lián)的同種異體肌腱修復(fù)兔跟腱損傷的實(shí)驗(yàn)研究

方 波 慈 元 宗 剛

大連市第二人民醫(yī)院，遼寧大連 116000

目的尋找一種新的方法對(duì)同種異體肌腱進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)處理來(lái)改善其修復(fù)效果，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法采用超深低溫冷凍法獲得兔同種異體肌腱，應(yīng)用碳化二亞胺對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)并肝素化，檢測(cè)其組織相容性；將交聯(lián)組和未交聯(lián)組肌腱對(duì)兔跟腱損傷進(jìn)行修復(fù)，觀察并對(duì)比不同時(shí)間段兩組的腱骨愈合情況。結(jié)果1、4周EDC交聯(lián)組炎癥反應(yīng)分級(jí)（Ⅰ～Ⅱ）均較未交聯(lián)組（Ⅲ～Ⅳ）輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.020、0.030)；移植實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)交聯(lián)并肝素化的肌腱在修復(fù)跟腱損傷中的愈合能力比未交聯(lián)的肌腱強(qiáng)，Sharpey’s纖維出現(xiàn)早，縮短了腱骨愈合時(shí)間。結(jié)論經(jīng)超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)共同處理肌腱，增強(qiáng)其穩(wěn)定性,降低了同種異體肌腱的免疫原性，促進(jìn)肌腱與骨的愈合。

同種異體肌腱；超深低溫冷凍；碳化二亞胺；移植

目前運(yùn)動(dòng)損傷、交通意外造成的跟腱損傷明顯增多，處理這類(lèi)損傷目前主要采用自體肌腱移植重建。由于自體肌腱取材時(shí)會(huì)造成一定程度的副損傷，且自體組織來(lái)源有限，使得同種異體肌腱的研究得以快速發(fā)展。而同種異體肌腱移植成功的關(guān)鍵是如何降低或抑制移植物的抗原性。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)超深低溫冷凍及應(yīng)用碳化二亞胺處理肌腱以探求其降低同種異體肌腱抗原性的可能性，為進(jìn)一步開(kāi)展臨床研究奠定基礎(chǔ)，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 同種異體肌腱的制備

實(shí)驗(yàn)于2011—2013年之間進(jìn)行，取新西蘭大白兔稱(chēng)重，按30 mg/kg用戊巴比妥鈉靜脈麻醉，無(wú)菌條件下取兔肌腱，生理鹽水反復(fù)沖洗浸鮮肌腱置入由10%二甲基亞砜及純小牛血清組成的冷凍保護(hù)液中,室溫下平衡后置入液氮罐氣液面6 h，再浸入液氮中貯存3個(gè)月。復(fù)蘇:40℃水浴快速?gòu)?fù)溫,含10%FCS的RPMI 1640液洗滌去除冷凍保護(hù)劑后在室溫下浸泡在3%過(guò)氧化氫中3h后，用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，30 min/次。將其放入1：1氯仿和甲醛混合溶液中脫脂 4 h,用蒸餾水反復(fù)沖洗 3次，30 min/次。真空冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.2 同種異體肌腱的交聯(lián)并肝素化

肌腱用50 mmol/L MES緩沖液浸泡24 h，與EDC交聯(lián)液（含50 mmol/L MES,5 mmol/L EDC,5mmol/L NHS,用40%乙醇配制），室溫交聯(lián)6 h后，95%乙醇漂洗2次，30 min/次,PBS漂洗2次共24 h，Hepes緩沖液漂洗4次，20 min/次。真空冷凍干燥后,環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.3 免疫原性實(shí)驗(yàn)

選取雄性SD大鼠40只,體重為(250±20)g。實(shí)驗(yàn)前背部剃毛,常規(guī)消毒,按0.35 mL/kg的水合氯醛進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)分兩組,每組20只。各組脊背皮下分別埋置上述兩組肌腱（1組為EDC交聯(lián)，2組為未處理組），3～0絲線縫合傷口,定期換藥。分別于術(shù)后第1、4周以脫頸法個(gè)處死老鼠 10只，取大鼠皮下埋藏組織活檢,HE染色觀察移植大鼠皮下后的免疫反應(yīng)。觀察炎性反應(yīng)分級(jí)[1]I級(jí)為試樣周?chē)匆?jiàn)或僅見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞；II級(jí)為試樣周?chē)梢?jiàn)少量淋巴細(xì)胞；III級(jí)為試樣周?chē)梢?jiàn)少量嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和巨細(xì)胞反應(yīng)；Ⅳ級(jí)為試樣周?chē)梢?jiàn)以嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)，可見(jiàn)吞噬細(xì)胞。

1.4 同種異體肌腱移植

采用成年兔30只，隨機(jī)分為兩組，分別于雙側(cè)跟腱止點(diǎn)處切斷[2]。1組為采用未處理的同種異體肌腱進(jìn)行修復(fù)，2組采用超深低溫冷凍及EDC交聯(lián)并肝素化的同種異體肌腱移植進(jìn)行修復(fù)。術(shù)后分別于1、3、6個(gè)月處死動(dòng)物，取材作光鏡和掃描電鏡。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件實(shí)現(xiàn)，體內(nèi)組織相容性實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 結(jié)果

①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部成活，手術(shù)切口均無(wú)感染和移植物排出。未交聯(lián)組埋植于大鼠皮下組織1周，光鏡下見(jiàn)肌腱變得疏松，纖維間隙增大，部分纖維變得模糊，基質(zhì)周?chē)M織水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),炎癥反應(yīng)分級(jí)多為III～Ⅳ級(jí)，見(jiàn)圖1。

圖1 未交聯(lián)組1周

②4周時(shí)，纖維組織大部分纖維碎裂，降解，正常的纖維排列結(jié)構(gòu)消失，組織水腫消退，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，但少量炎癥細(xì)胞內(nèi)部浸潤(rùn)，炎癥反應(yīng)分級(jí)多為II～I(xiàn)II級(jí)，見(jiàn)圖2。

圖2 未交聯(lián)組4周

③EDC交聯(lián)并肝素化組埋于大鼠皮下后，1周取材表現(xiàn)為均質(zhì)致密結(jié)構(gòu)，周?chē)装Y反應(yīng)輕微，鏡下見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥反應(yīng)分級(jí)I～I(xiàn)II級(jí)，見(jiàn)圖3。

圖3 交聯(lián)組1周

④4周取材時(shí)，結(jié)構(gòu)仍為均質(zhì)致密的纖維排列，但纖維間有大量的與纖維走行一致的細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)在其周?chē)写罅康男律?xì)血管形成。炎癥反應(yīng)分級(jí)為I～I(xiàn)I級(jí)，見(jiàn)圖4。

圖4 交聯(lián)組4周

⑤對(duì)4周取材的標(biāo)本切片進(jìn)行α-SMA免疫組化染色，可見(jiàn)EDC交聯(lián)并肝素化的同種異體肌腱內(nèi)部不均勻的棕黃色片狀染色區(qū)域，提示其內(nèi)部有表達(dá)α-SMA的細(xì)胞浸潤(rùn)多數(shù)為血管內(nèi)皮細(xì)胞，見(jiàn)圖5、6。

圖5 α-SMA免疫組化染色

圖6 α-SMA免疫組化染色

⑥數(shù)據(jù)表明1、4周EDC交聯(lián)組炎癥反應(yīng)分級(jí)均較未交聯(lián)組輕，χ2值分別為13.6、14.6，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)表1。

表1 炎癥反應(yīng)分級(jí)

2.2 同種異體肌腱移植

2.2.1 組織學(xué)觀察 術(shù)后1個(gè)月未處理組在肌腱于骨之間可見(jiàn)明顯縫隙，存在少量的疏松結(jié)締組織，見(jiàn)圖7。

圖7 未交聯(lián)組手術(shù)后1個(gè)月

實(shí)驗(yàn)組肌腱和骨之間出現(xiàn)致密的結(jié)締組織，可見(jiàn)少量排列紊亂的Sharpey’s纖維,但未愈合，見(jiàn)圖8。

術(shù)后3個(gè)月未處理組在肌腱與骨之間出現(xiàn)排列無(wú)序的Sharpey’s纖維，有疏松結(jié)締組織填充，但部分移植肌腱與骨之間仍有分離，以隧道內(nèi)口較明顯，見(jiàn)圖9。

圖8 交聯(lián)組術(shù)后1個(gè)月

圖9 未交聯(lián)組術(shù)后3個(gè)月

實(shí)驗(yàn)組肌腱與骨隧道之間出現(xiàn)較多的排列有序的Sharpey’s纖維，并見(jiàn)纖維軟骨填充，但無(wú)鈣化軟骨形成，見(jiàn)圖10。

圖10 交聯(lián)組術(shù)后3個(gè)月

術(shù)后6個(gè)月未處理組在肌腱與骨之間出現(xiàn)較多的Sharpey’s纖維，部分排列有序，并出現(xiàn)纖維軟骨填充，見(jiàn)圖11。

圖11 未交聯(lián)組術(shù)后6個(gè)月

實(shí)驗(yàn)組隧道有較多的鈣化軟骨，隧道中部、外部可見(jiàn)明顯的肌腱纖維、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨 4層結(jié)構(gòu)，形成直接連接，部分區(qū)域如肌腱末端等結(jié)構(gòu)相似，組織均勻，難以分辨清楚，見(jiàn)圖12。

圖12 交聯(lián)組術(shù)后6個(gè)月

2.2.2 電鏡 掃描電鏡發(fā)現(xiàn)術(shù)后1個(gè)月，經(jīng)超深低溫冷凍及EDC交聯(lián)的同種異體肌腱與骨的交界區(qū)纖維組織和骨組織間可見(jiàn)排列不規(guī)則的類(lèi)膠原纖維樣組織，在切面可見(jiàn)大量的紅細(xì)胞存在，證明此區(qū)血管豐富，見(jiàn)圖13。

圖13 交聯(lián)術(shù)后1個(gè)月

3個(gè)月時(shí)，交界區(qū)仍可見(jiàn)肌腱纖維排列紊亂，并有部分機(jī)化，有大量排列不規(guī)則的類(lèi)膠原纖維，但界限不清，成骨的功能強(qiáng)，愈合能力強(qiáng)，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞順纖維走形嵌入，見(jiàn)圖14。

圖14 交聯(lián)術(shù)后3個(gè)月

6個(gè)月時(shí)，交界區(qū)內(nèi)可見(jiàn)，排列有一定的方向性的類(lèi)膠原纖維，可見(jiàn)血管組織，并有大量的成纖維細(xì)胞和纖維母細(xì)胞，見(jiàn)圖15。

圖15 交聯(lián)術(shù)后6個(gè)月

3 討論

同種異體肌腱的預(yù)處理方式主要有冷凍、凍干和化學(xué)處理3種[3]，目前，冷凍處理是國(guó)內(nèi)、外公認(rèn)處理肌腱抗原性有效的方法。冷凍包括低溫、深低溫及超深低溫，但降低肌腱抗原性,減輕免疫排斥反應(yīng)同時(shí)使其抗張強(qiáng)度顯著降低,且愈合過(guò)程完全依賴(lài)于外源性愈合,易產(chǎn)生嚴(yán)重粘連,影響術(shù)后效果[4]，且仍有較低的抗原性，存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。肌腱的化學(xué)處理主要采用低毒性的EDC，其作用機(jī)制是是“零長(zhǎng)度交聯(lián)”，在膠原間形成交聯(lián)的同時(shí)，并不引入新的物質(zhì)，降低抗原性的同時(shí)保持肌腱的生物穩(wěn)定性[5-6]。該實(shí)驗(yàn)采用超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)共同處理肌腱，尋求一種新的可行的降低抗原性提高生物穩(wěn)定性的方法。

同種異體肌腱移植目前主要的問(wèn)題有1肌腱的免疫反應(yīng)問(wèn)題2肌腱愈合問(wèn)題。谷守濱等[7]研究表明：EDC交聯(lián)同種異體肌腱能夠降低其抗原性，增加其抗酶降解的能力，且無(wú)明顯的細(xì)胞毒性。靳憲輝等[8-9]應(yīng)用碳化二亞胺交聯(lián)改性的脫細(xì)胞豬肌腱成功修復(fù)兔跟腱缺損，表明EDC交聯(lián)同種異體肌腱有組織相容性好、移植排斥反應(yīng)輕、生物力學(xué)性能強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。該研究免疫原性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)EDC交聯(lián)組肌腱鏡下觀察結(jié)構(gòu)仍為均質(zhì)致密的纖維排列，但纖維間有大量的與纖維走行一致 的細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)在其周?chē)写罅康男律?xì)血管形成。炎癥反應(yīng)分級(jí)為I-II級(jí)，較未交聯(lián)組輕微。表明經(jīng)超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)共同處理肌腱具有低抗原性和良好的生物穩(wěn)定性。肌腱與骨的愈合的特征是骨隧道內(nèi)移植物與骨面間出現(xiàn)Shapery纖維。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)移植物光鏡下發(fā)現(xiàn)交聯(lián)組在術(shù)后1個(gè)月出現(xiàn)Sharpey’s纖維，但量少且排列紊亂；3個(gè)月肌腱與骨隧道之間出現(xiàn)較多的排列有序的Sharpey’s纖維，并見(jiàn)纖維軟骨填充，將肌腱與骨連接起來(lái)；6個(gè)月時(shí)隧道有較多的鈣化軟骨，隧道中部、外部可見(jiàn)明顯的肌腱纖維、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨四層結(jié)構(gòu)，形成直接連接。然而，未交聯(lián)組Sharpey’s纖維，出現(xiàn)較晚?？梢?jiàn)經(jīng)超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)共同處理肌腱愈合能力比未交聯(lián)的肌腱強(qiáng)，縮短了腱骨愈合時(shí)間。

該文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)同種異體肌腱修復(fù)跟腱損傷的優(yōu)越性，將其作為制備同種異體肌腱預(yù)處理步驟的提供了新的思路，其生物力學(xué)特性還有待進(jìn)一步研究。

[1]Shin'oka T.Clinical results of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells[J].Nippon Geka Gakkai Zasshi 2004，105:459-463.

[2]周建牛，張長(zhǎng)春，潘功平，等.冷凍保存同種異體骨.ACL-骨移植實(shí)驗(yàn)研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志，2004（6）：546，549.

[3]耿樹(shù)巖，王成琪.同種異體肌腱移植的研究進(jìn)展[J].實(shí)用手外科雜志，2006（20）：163-165.

[4]唐林俊,程國(guó)良,方光榮,等.反復(fù)凍融及超深低溫處理的異體肌腱移植的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，1998（12）:241-245.

[5]余喜訊，成敏.改造天然生物組織為血管支架材料的預(yù)處理方法[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2004，21(3)∶476-481.

[6]Olde Damink LH,Dijkstra PJ,van Luyn MJ,et al.Cross-linking of dermal sheep collagen using a water soluble carbodiimide[J].Biomaterials，1996，17(8):765-773.

[7]谷守濱，何金久，方波.碳化二亞胺交聯(lián)同種異體肌腱修復(fù)兔前交叉韌帶損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志，2011，13（4）:353-357.

[8]靳憲輝,高春光,崔勝杰，等.碳化二亞胺交聯(lián)改性脫細(xì)胞異種豬肌腱修復(fù)跟腱缺損[J].中國(guó)組織工程研究，2013（12）：71-76.

[9]靳憲輝,張慶勝,楊建博,等.脫細(xì)胞近交系微型豬肌腱修復(fù)兔跟腱缺損[J].中國(guó)組織工程研究，2013（16）：2968-2972.

Empirical Study of Rabbit's Tendon Allograft Obtained by Ultra-deep Frozen and Cross-linked by EDC/NHS Repairing Injure of Achilles Tendon

FANG BoCI Yuan ZONG Gang
Second People's Hospital of Dalian City,Dalian,Liaoning Province,116000,China

ObjectiveTo find a new way to improve the repairing effect by further pretreating tendon allograft so as to provide an experimental basis and theory evidence for clinical application.MethodsThe rabbit's tendon allograft was obtained by ultra-deep frozen then cross-linked and heparinized by EDC/NHS and detected histocompatibility.Injure of rabbit achilles tendon was repaired by the tendon allograft of management and nulli-management.The aim was to observe and contrast tendon-bone healing of two sets in the different time.ResultsEDC crosslinking group grade inflammation(Ⅰ～Ⅱ)was lighter than those of uncross-linked group(Ⅲ～Ⅳ)at 1 or 4 weeks，the difference was statistically significant(P values were 0.020,0.030);the transplantation showed that the capability of agglutination of the tendon allograft of management was more powerful than nulli-management set on repairing injure.The time of Sharpey's fibers appearing was earlier,and the cross-linking and heparinization process can shorten tendon-bone healing time.ConclusionTendon allograft obtained by ultra-deep frozen and cross-linked by EDC/NHS reinforces its constancy and reduces immunogenicity as well as promotes tendon-bone healing.

Tendon allograft;Ultra-deep frozen;Carbodiimide;Transplant

R686.1

A

1674-0742（2015）03（a）－0016-04

2014-11-25）

方波（1982.6-），男，吉林人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事脊柱外科研究工作。