炮制對(duì)蒺藜皂苷類成分的影響

李瑞海， 馮 琳， 馬欣悅， 劉書平， 孫延君， 賈天柱（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

[飲片炮制]

炮制對(duì)蒺藜皂苷類成分的影響

李瑞海， 馮 琳， 馬欣悅， 劉書平， 孫延君， 賈天柱（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600）

目的測(cè)定炮制前后蒺藜的皂苷成分含有量并推測(cè)其炮制機(jī)理。方法蒺藜甲醇提取液的正丁醇部位的HPLC分析采用Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20），檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；采用高氯酸作顯色劑，蒺藜皂苷元為指標(biāo)，測(cè)定蒺藜總皂苷。結(jié)果蒺藜皂苷元在0.82～7.38μg和24.6～86.1μg有良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為99.3%和100.7%。蒺藜經(jīng)清炒法、烘制法炮制后，其總皂苷含有量下降，皂苷元含有量增加。結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒺藜烘制與清炒作用相同，其機(jī)理可能為其皂苷經(jīng)炒制轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)性質(zhì)更為穩(wěn)定的蒺藜皂苷元成分。

蒺藜；炒制；烘制；蒺藜皂苷元；比色法；炮制機(jī)理

蒺藜為蒺藜科蒺藜Tribulus terrestris L.的干燥成熟果實(shí)。具有平肝解郁、活血祛風(fēng)、明目、止癢之功效［1］，臨床常用于頭痛眩暈、胸脅脹痛、乳閉乳癰、目赤翳障、風(fēng)疹瘙癢［2］。其性味辛、苦，微溫；有小毒。歸肝經(jīng)。有報(bào)道蒺藜的嫩莖鮮品被馬、羊等動(dòng)物食后會(huì)引起中毒，但曬干后可作為藥物使用，而且經(jīng)炮制后應(yīng)用于臨床［3-4］，提示蒺藜經(jīng)一定方法處理后可能存在 “減毒增效”的作用，目前尚無相關(guān)報(bào)道。經(jīng)查閱文獻(xiàn)和歷版 《中國(guó)藥典》發(fā)現(xiàn)，蒺藜多為火制。蒺藜火制方法始于唐代，有 “燒”、“炒焦”、“炒 （杵）去刺”、“熬”等。宋代火制方法有 “微炒”、 “熬令黃”等，酒制方法有 “酒蒸”、“酒炒”。《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定蒺藜炮制為 “炒蒺藜，取凈蒺藜，照清炒法 （附錄ⅡB）炒至微黃色”［5-7］。本研究擬采用傳統(tǒng) “炒法”，對(duì)蒺藜進(jìn)行炮制。又因?yàn)?“炒”制的過程主要的影響因素是溫度的高低和作用時(shí)間長(zhǎng)短的不同，因此本研究擬采用烘箱烘制蒺藜輔助說明“炒”制的作用。參考已發(fā)表文獻(xiàn) ［8-14］，本研究擬采用傳統(tǒng) “炒”法和烘制法，并利用HPLC法、比色法，對(duì)蒺藜成分在炮制前后的變化進(jìn)行對(duì)比研究，初步說明 “炒”制蒺藜的炮制機(jī)理。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司），安捷倫色譜工作站；U-3010紫外分光光度計(jì) （日本日立公司）UV Solutions 2.1工作站，十萬分之一電子天平 （德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 試藥 蒺藜皂苷元TTS對(duì)照品 （25R-spirostan-4-ene-3，12-dione）（本實(shí)驗(yàn)室分離純化，純度＞98%）；高效液相色譜用水為蒸餾水，甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒺藜皂苷元HPLC測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Welch Ultimate LP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（80∶20），體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm；柱溫30℃［8-9］。

2.1.2 供試品溶液制備 取蒺藜藥材，粉碎，精密稱取1 g，加甲醇10 m L，加熱回流處理3次，每次1 h。過濾，合并濾液，蒸干。加甲醇轉(zhuǎn)移并定容至10 mL量瓶中，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

2.1.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱定蒺藜皂苷元（25R-spirostan-4-ene-3，12-dione）對(duì)照品適量，配成0.123 mg/mL溶液，備用。

2.1.4 測(cè)定結(jié)果 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20μL。依次進(jìn)樣，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜圖，如圖1。

圖1 蒺藜皂苷元(A)及樣品(B)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of Tribulus terrestris saponins(A)and sam p le(B)

2.2 蒺藜總皂苷的比色法測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蒺藜皂苷元對(duì)照品加甲醇配制成0.123 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蒺藜藥材約0.5 g，粉碎過篩 （細(xì)粉），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流處理2 h，取出放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0mL溶解，用水飽和正丁醇振搖提取5次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次5 mL，棄去氨試液，正丁醇液蒸干。殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻。

2.2.3 樣品總皂苷測(cè)定 精密量取供試品2 mL，置于10 mL具塞試管中，水浴揮干甲醇，加高氯酸5.0 mL，60℃水浴保溫15 min，以不加樣品的高氯酸溶液為空白對(duì)照，在285 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度的測(cè)定，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品溶液總皂苷的量。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 HPLC法標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取蒺藜皂苷元對(duì)照品加甲醇配制成0.41 mg/mL，分別精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，以甲醇溶解并定容于10 mL量瓶中，分別量取20μL，注入HPLC色譜儀中，結(jié)果得回歸方程：y=264.947x-8.693，r=0.999 7，表明在0.82～7.38μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別吸取0.123 mg/mL對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于10 mL具塞試管中，揮干溶劑，加高氯酸溶液5 mL，60℃水浴保溫15 min，取出后立即冰水浴冷卻至室溫，搖勻，在285 nm測(cè)定對(duì)照品吸收度A，結(jié)果得線性方程y=0.008 6x-0.043 1，r= 0.999 2，表明在24.6～86.1μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，在 “2.1”、“2.2”項(xiàng)條件下，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD值分別為1.1%、1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) HPLC法所制樣品于10 h內(nèi)測(cè)定RSD為1.3%，比色法于1 h內(nèi)測(cè)定RSD為 0.7%，供試品溶液相對(duì)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品分別按 “2.1”、“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行處理，結(jié)果RSD值分別為1.0%、1.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 精密稱取蒺藜樣品1 g，加1.23 mg/mL對(duì)照品溶液1 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，按 “2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定。精密稱取蒺藜樣品0.5 g，加入1.0 mL對(duì)照品溶液（9.81 mg/mL），按 “2.2.2”項(xiàng)處理，按 “2.3”項(xiàng)顯色后，于285 nm下測(cè)定，結(jié)果表明方法回收率試驗(yàn)結(jié)果良好，具體見表1。

表1 HPLC法(比色法)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.4 蒺藜炮制品制備

2.4.1 清炒 蒺藜置炒鍋內(nèi)，文火加熱，不斷翻炒，至藥物表面呈黃色，取出，放涼，即得。

2.4.2 烘制 蒺藜置電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱內(nèi)，分別于120、140、200℃各烘制35 min。將上述樣品、生品置于干燥器內(nèi)，放置24 h后，備用。

2.5 蒺藜皂苷、蒺藜皂苷元測(cè)定結(jié)果 按前述方法，對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.2 Test resu lts of six sam ples

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蒺藜傳統(tǒng)炮制過程清炒法，其炮制結(jié)果為總皂苷下降，蒺藜皂苷元TTS的含有量有所增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明烘制法具有相同的作用結(jié)果，蒺藜經(jīng)烘制后，蒺藜總皂苷含有量下降，而蒺藜皂苷元TTS的含有量有顯著增加，其中以烘制200℃，35 min最為明顯，增加了近15倍。

本課題其他實(shí)驗(yàn)內(nèi)容表明蒺藜皂苷元TTS具有較強(qiáng)的生物活性作用，因此，對(duì)于獲得更多的蒺藜皂苷元TTS成分，烘制法具有方法簡(jiǎn)便易行，條件容易控制等優(yōu)勢(shì)?？稍诒緦?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)后，確定烘制法作為炒制的替代炮制方法的可行性。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，初步分析蒺藜經(jīng)炮制其成分變化的過程為皂苷轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)性質(zhì)更為穩(wěn)定的蒺藜皂苷元成分。蒺藜含有大量的皂苷類成分，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是多為甲基原薯蕷皂苷元雙糖鏈皂苷，通常在蒺藜皂苷元的C-3和C-26位均連有糖鏈，其糖鏈數(shù)量差異很大，其代表化合物為甲基原薯蕷皂苷（methylprotodioscin）如圖2中A所示。經(jīng)炮制后雙糖鏈皂苷含有量降低很多，單糖鏈皂苷 （圖2中C所示）、短糖鏈皂苷 （圖2中B所示）及皂苷元 （圖2中D所示）的含有量增加，提示雙糖鏈皂苷經(jīng)炮制可能存在轉(zhuǎn)化過程，過程如圖所示，本研究將通過另外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確雙糖鏈皂苷轉(zhuǎn)化的過程。

有報(bào)道蒺藜的嫩莖鮮品被馬、羊等動(dòng)物食后會(huì)引起中毒，但曬干后可作為藥物使用，而且經(jīng)炮制后應(yīng)用于臨床，提示蒺藜經(jīng)一定方法處理后可能存在 “減毒增效”的作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蒺藜經(jīng)炮制后總皂苷下降，蒺藜皂苷元TTS的含有量增加，兩者是否存在一定聯(lián)系，是否蒺藜總皂苷是毒性成分，而蒺藜皂苷元是活性成分，其進(jìn)一步的深入研究具有意義。

圖2 蒺藜雙糖鏈皂苷經(jīng)炮制可能存在轉(zhuǎn)化過程Fig.2 Biglycan saponins of Tribulus terrestris m ay exist transformation p rocess after processing

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Effect of processing on Tribulus terrestris saponins conent

LIRui-hai， FENG Lin， MA Xin-yue， LIU Shu-ping， SUN Yan-jun， JIA Tian-zhu
（College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional ChineseMedicine，Dalian 116600，China）

AIMTomeasure the saponins content from Tribulus terrestris before and after the processing and to speculate their processingmechanism of action.METHODSThe analyses of n-butanol part of Tribulus terrestris methanolic extractwere performed on Ultimate LP-C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with methanol water（80∶20）asmobile phase，the detection wavelength was setat203 nm.The perchloric acid was adopted as developer and 25R-spirostan-4-ene-3，12-dione as themarker to determine the Tribulus terrestris saponins content.RESULTS25R-spirostan-4-ene-3，12-dione had good linear relationship in the range of0.82-7.38μg for HPLC and 24.6-86.1μg for colorimetry，their average recoveries were 99.3%and 100.7%，respectively.After stir-baking or stoving，total saponins from Tribulus terrestris decreased，and 25R-spirostan-4-ene-3，12-dione content increased.CONCLUSIONThe experimental data shows that stir-baking or stoving has the same effect on the processing of Tribulus terrestris，theirmechanism of action is related to the change of saponins into structural stable aglycone.

Tribulus terrestris；stir-baking；stoving；25R-spirostan-4-ene-3，12-dione；colorimetry；processing mechanism

R283

：A

：1001-1528（2015）07-1526-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.028

2014-08-06

國(guó)家藥典委員會(huì)，國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)科研項(xiàng)目201203

李瑞海，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究生導(dǎo)師，從事藥物制劑方面研究。Tel：（0411）85890183，E-mail：1801517231@qq.com