丹皮酚非離子型類脂囊泡的制備

王建筑， 王欣欣， 畢研平， 李 菲， 郝吉福

（山東泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016）

丹皮酚非離子型類脂囊泡的制備

王建筑， 王欣欣， 畢研平， 李 菲， 郝吉福

（山東泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016）

目的制備丹皮酚非離子型類脂囊泡，并考察其體外釋放度。方法采用薄膜分散-超聲法制備丹皮酚非離子型類脂囊泡，以包封率為指標(biāo)，采用單因素考察法優(yōu)選丹皮酚類脂囊泡的處方組成和制備工藝，并進(jìn)行體外釋放度考察。結(jié)果采用司盤-60∶膽固醇 （1∶1）為囊材，藥脂比例為1∶10，40℃條件下水合60min，以頻率400 Hz超聲5 min，可制得丹皮酚非離子型類脂囊泡，包封率平均為78.4%，其體外釋放過程與丹皮酚溶液相比較具有明顯緩釋作用。結(jié)論該方法適合于制備丹皮酚非離子型類脂囊泡。

丹皮酚；類脂囊泡；薄膜分散-超聲法；體外釋放。

丹皮酚 （paeonol）又名牡丹酚，是中藥牡丹皮和徐長卿的主要活性成分，具有祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過敏、活血、抗病毒和抑制變態(tài)反應(yīng)等藥理作用［1-4］，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)O2-自由基的產(chǎn)生，使皮膚中色素還原退色，消瘀化斑，對(duì)色斑、肌肉痛、皮膚瘙癢、牛皮癬、帶狀皰疹、濕疹具有較好的防治效果［4-5］。除此之外，還具有較強(qiáng)的抗癌活性。它能通過影響腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)等機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。目前對(duì)于丹皮酚的制劑研究大多以載體的形式進(jìn)行包裹，如脂質(zhì)體，微囊，微球，自微乳等［6-9］。

非離子表面活性劑囊泡（Non-ionic surfactant based vesicles，簡稱niosomes），又稱類脂囊泡，是非離子型表面活性劑和膽固醇在親水介質(zhì)中能夠自組裝形成的具有閉合雙分子層膜結(jié)構(gòu)的封閉體系［10-13］，其結(jié)構(gòu)類似于脂質(zhì)體，但制備類脂囊泡時(shí)的材料中不含磷脂，可以避免磷脂在使用貯存中的的氧化降解，且類脂囊泡兼具有脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的緩釋、高效、低毒及良好的生物相容性和可降解性，

可根據(jù)實(shí)際用途設(shè)計(jì)其結(jié)構(gòu)，因此類脂囊泡技術(shù)已經(jīng)成為化學(xué)、藥學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一［14-16］。本研究將丹皮酚制成非離子型類脂囊泡，可將不溶于水的且穩(wěn)定性差的丹皮酚包裹于其中，考察類脂囊泡對(duì)丹皮酚的包封作用及其體外釋放作用的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 S-54紫外分光光度計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）；SIGMA 3K30型超速冷凍離心機(jī)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) （寧波新芝生物科技股份有限公司）；MD34型透析袋 （截留分子質(zhì)量8 000～14 000）。

1.2 材料和試劑 丹皮酚 （泰安中薈植物生化有限公司）；司盤-20（Span20）；司盤-40（Span40）；司盤-60（Span60）；司盤-80（Span80）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；膽固醇 （上海長城生化制藥廠）；其余所用試劑均為分析純 （市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 包封率的測(cè)定

2.1.1 丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取適量丹皮酚用適量甲醇溶解后制成質(zhì)量濃度為20μg/mL的貯備液。精密量取上述貯備液適量，分別加甲醇稀釋成1、2、4、6、8μg/m L的丹皮酚溶液。以甲醇為空白對(duì)照，于波長275 nm處測(cè)定各溶液的吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，丹皮酚質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為A=89.707C+0.009 8（r=0.999 9，n=5），結(jié)果表明，丹皮酚在1～8μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 取同一份丹皮酚類脂囊泡，照 “2.1.4”項(xiàng)下方法測(cè)定包封率，共測(cè)5次，計(jì)算日內(nèi)精密度RSD為0.9% （n=5）。另取一份丹皮酚類脂囊泡，連續(xù)5 d，每天在同一時(shí)間測(cè)定包封率，計(jì)算日間精密度RSD為1.7% （n=5），表明本方法精密度良好。

2.1.3 回收率試驗(yàn) 精密量取質(zhì)量濃度為6 μg/mL的對(duì)照品溶液2、4、6 mL，各置于10mL量瓶中，分別加入空白類脂囊泡2 m L，用甲醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，丹皮酚的平均回收率為97.36%，RSD為2.34%（n=3）。

2.1.4 包封率測(cè)定方法 取制備好的丹皮酚類脂囊泡液搖勻，精密量取0.1 mL，適當(dāng)稀釋后加甲醇破乳溶解，高速離心后測(cè)定類脂囊泡中總的藥物量m總。

取制備好囊泡混懸液1.0 mL置于離心管中，以轉(zhuǎn)速20 000 r/min高速離心15 min，取其上清液，用甲醇稀釋后，測(cè)吸光度A，計(jì)算游離藥物的量m游。

包封率：EE=［（m總-m游）/m總］×100%

2.2 丹皮酚非離子型類脂囊泡的制備和優(yōu)化

2.2.1 丹皮酚類脂囊泡的制備 采用薄膜分散-超聲法制備丹皮酚類脂囊泡。首先稱取處方量的囊泡載體材料 （司盤、膽固醇）和藥物丹皮酚，加入適量二氯甲烷使其溶解，然后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃減壓蒸發(fā)至于瓶壁形成均勻薄膜為止，向燒瓶中加入適量pH 7.4磷酸鹽緩沖液，控溫并攪拌水合一定時(shí)間形成混懸液，然后將此混懸液冰浴下探頭超聲使之分散均勻，并依次通過 0.80、0.45μm微孔濾膜即得丹皮酚類脂囊泡。

2.2.2 囊材篩選 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備丹皮酚類脂囊泡時(shí)，囊泡材料 （司盤-膽固醇為1∶1）總質(zhì)量濃度為10 mg/m L，加入藥物質(zhì)量濃度為1 mg/m L，40℃下加入磷酸鹽緩沖液水合30 min，完成后采用300 W探頭超聲10 min，考察不同種類司盤作為囊材時(shí)對(duì)載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果見表1，以Span60制備的囊泡包封率最高，且制備的囊泡外觀呈均一且有藍(lán)色乳光的混懸液，所以選擇Span60作為囊材進(jìn)行下一步研究。

表1 司盤種類對(duì)丹皮酚類脂囊泡包封率的影響Tab.1 Effect of SpanX on the entrapment efficiency of paeonol niosom es

2.2.3 Span60與膽固醇比例的選擇 改變類脂囊泡載體材料Span60與膽固醇比例 （3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），以藥脂比為1∶5采用相同的制備工藝制備囊泡，考察不同的囊材比例對(duì)載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果見表2，當(dāng)Span60∶膽固醇為1∶1時(shí)，囊泡的包封率較高，所以確定處方中囊材與膽固醇比例1∶1。

表2 司盤60和膽固醇比例對(duì)丹皮酚類脂囊泡包封率的影響Tab.2 Effect of Span60—cholesterol ratio on the entrapment efficiency of paeonol niosomes

2.2.4 類脂囊泡藥脂比例對(duì)包封率的影響：分別采用不同的藥脂比例 （1∶5、1∶10、1∶20、1∶40），以相同的制備工藝制備類脂囊泡，考察藥脂比例的變化對(duì)丹皮酚類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果見表3，當(dāng)藥脂比例1∶10時(shí)，囊泡的包封率最佳。

表3 不同藥脂比例對(duì)丹皮酚類脂囊泡包封率的影響Tab.3 Effect of drug-lipid ratio on the entrapment efficiency of paeonol niosomes

2.2.5 水合時(shí)間的確定 采用上述優(yōu)化的處方組成制備丹皮酚類脂囊泡，加入水合介質(zhì)后，40℃水浴下分別考察不同的水合時(shí)間 （30、60、90 min）對(duì)載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果包封率分別為63.6%、70.3%、71.0%，表明水合時(shí)間越長，包封率越高，但水合時(shí)間超過60 min后，時(shí)間延長對(duì)包封率影響不明顯，故確定水合時(shí)間為60 min。

2.2.6 水合溫度的確定 以優(yōu)化的處方組成制備載藥類脂囊泡，加入水合介質(zhì)后，分別以不同的水合溫度 （30、40、50℃）水合60 min，考察水合溫度對(duì)載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果包封率分別為65.2%、71.5%、71.7%，因此，確定最終水合溫度為40℃。

2.2.7 超聲工藝的影響 制備載藥類脂囊泡水合過程完成后，分別采用不同功率進(jìn)行探頭超聲不同時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：超聲過程中超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)載藥類脂囊泡包封率無顯著影響，可能超聲過程改變的只是類脂囊泡的粒徑，因此確定超聲工藝為以400 W的功率探頭超聲5 min。

2.3 處方驗(yàn)證 通過以上考察最終確定丹皮酚類脂囊泡處方組成和制備工藝為以Span60-膽固醇（比例為1∶1）為囊材，藥脂比例1∶10，加入磷酸鹽緩沖液以40℃水合60 min，完成后以400 W的功率探頭超聲5 min，平行制備3次，結(jié)果表明得到的丹皮酚類脂囊泡為帶有藍(lán)色乳光均一的白色混懸液，平均包封率為76.9%，RSD為3.3%。

2.4 顯微觀察形態(tài) 將制備好的類脂囊泡 （未經(jīng)微孔濾膜過濾和超聲處理）置于顯微鏡下觀察，由圖1可見，囊泡外觀呈完整圓形或橢圓形。

圖1 丹皮酚類脂囊泡的顯微形態(tài) (x 400)Fig.1 M icro-morphology of paeonol niosomes(x400)

2.5 丹皮酚類脂囊泡的體外釋放度測(cè)定 分別精密吸取丹皮酚溶液（0.1 mg丹皮酚溶解在10 m L甲醇中）和丹皮酚類脂囊泡各0.5 mL置面積大小相同的透析袋中，并將其固定于溶出儀的攪拌漿上，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液200 m L為釋放介質(zhì)，在 （37±0.5）℃的恒溫下進(jìn)行體外釋放性能測(cè)定 （轉(zhuǎn)速50 r/min）。分別于不同時(shí)間點(diǎn)取樣為2 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量同溫的釋放介質(zhì)，樣品經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后，取體外釋放試驗(yàn)所得的樣品溶液，以甲醇為空白在274 nm出測(cè)定吸光度。計(jì)算其中丹皮酚的濃度，并計(jì)算體外釋放度，其體外釋放曲線見圖2。

圖2 丹皮酚類脂囊泡體外釋放曲線Fig.2 Cu rves for paeonol niosom es in vitro release

由圖2可以看出，溶液在1 h時(shí)釋放即達(dá)50%以上，5 h時(shí)釋放度即接近100%，而類脂囊泡1 h時(shí)只有 30%左右的釋放，18 h時(shí)釋放度接近100%，因此類脂囊泡明顯具有緩釋作用，且釋藥機(jī)制符合Higuchi方程。

3 討論

制備非離子型類脂囊泡常用的囊材有司盤、吐溫、賣澤及卞澤。由于丹皮酚為脂溶性藥物，所以本實(shí)驗(yàn)采用脂溶性的司盤作為囊材，以期取得到較高的包封率。

非離子表面活性劑囊泡的制備方法主要有注入法、薄膜分散法、超聲分散法、高壓乳化法和反向蒸發(fā)法。其中注入法制得的囊泡粒徑較大，高壓乳化法和反向蒸發(fā)法適用于水溶性藥物，而丹皮酚為脂溶性的藥物，所以本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備類脂囊泡，且該法制得的囊泡粒徑較小且均勻。

如果制備過程中用span-60，水合溫度應(yīng)保持在span-60的相變溫度 （53℃）以上，低于此溫度則形成的非離子囊泡膜流動(dòng)性較大，導(dǎo)致包封率降低。由于丹皮酚的熔點(diǎn)在50℃左右，所以水合溫度不宜高于53℃，否則包封率比較低。類脂囊泡的結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體類似，成囊時(shí)需有表面活性劑和穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的膽固醇。

在測(cè)定類脂囊泡包封率時(shí)，首先需要將包封的藥物與游離藥物進(jìn)行分離，分離方法的優(yōu)劣直接影響到包封率的測(cè)定結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中采用的是高速離心法。首先精密量取丹皮酚甲醇溶液適量，加至空白囊泡中，分別取該溶液1.5 mL，按20 000 r/min高速離心15min，平行做5份，測(cè)定上清液中丹皮酚的藥物含有量，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，丹皮酚-空白囊泡混合液通過高速離心法分離，加入的丹皮酚回收率均在95%以上，表明空白囊泡對(duì)游離丹皮酚基本無吸附。此法可以用于類脂囊泡混懸液中游離藥物的分離。

本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散法制備丹皮酚非離子型類脂囊泡，以包封率為指標(biāo)篩選，經(jīng)優(yōu)化后的處方組成和制備工藝制備得丹皮酚類脂囊泡包封率為76.9%，體外釋放度實(shí)驗(yàn)表明丹皮酚經(jīng)類脂囊泡包裹后，具有明顯的緩釋作用。并且利用非離子表面活性劑囊泡包裹藥物可以減少藥物在達(dá)到有效部位前被破壞、延長藥物的中半衰期、從而延長藥物的作用時(shí)間以及降低毒副作用的特點(diǎn)。

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Preparation of paeonol niosomes

WANG Jian-zhu， WANG Xin-xin， BIYan-ping， LIFei， HAO Ji-fu
（Department of Pharmacology，Taishan Medical College，Taian 271016，China）

paeonol；niosomes；film ultrasonic dispersion；in-vitro release

R969.1

：A

：1001-1528（2015）07-1467-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.016

2014-08-18

泰安市科技發(fā)展計(jì)劃 （201440774-16）

王建筑（1981—），男，碩士，講師，研究方向?yàn)樗幬镄聞┬团c新技術(shù)。Tel：13668681261，E-mail：jzwang@tsmc.edu.cn