雙氯芬酸鈉對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響的濃度、時間效應(yīng)

徐 偉 洪 盾 陳 真 袁赤亭 陳海嘯

疼痛是骨折常見的癥狀之一，為了緩解骨折及手術(shù)帶來的疼痛，臨床上常用非甾體抗炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)。NSAIDs 在骨科大量應(yīng)用之后，很多國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)NSAIDs(無論是選擇性和非選擇性)在產(chǎn)生消炎鎮(zhèn)痛作用的同時，對骨折的愈合也會產(chǎn)生不良影響［1，2］。主要表現(xiàn)為延長骨折愈合的時間，降低骨折愈合的強度，增加骨折的不愈合率。同時也有研究表明，NSAIDs 對骨折愈合的影響與藥物的濃度和干預(yù)時間有著直接的相關(guān)，藥物主要作用在骨折愈合的早期階段，而且短期的作用效果是可逆的［3，4］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在骨折愈合早期過程起著重要的作用:細(xì)胞因子的釋放引起B(yǎng)MSCs 的募集與增殖，然后BMSCs 向成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化，最后形成膜內(nèi)化骨或軟骨內(nèi)化骨［5］。以往研究主要著眼于臨床研究和動物實驗的研究，但是關(guān)于NSAIDs 對BMSCs 直接影響的實驗研究卻是不夠。雙氯芬酸鈉由于其強大的消炎鎮(zhèn)痛效果是臨床上廣泛應(yīng)用的一種NSAIDs，故本研究觀察不同濃度、不同干預(yù)時間的雙氯芬酸鈉對體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡及成骨分化的影響。

材料與方法

1.主要實驗試劑和設(shè)備:雙氯芬酸鈉(Sigma 公司)，DMEM 低糖培養(yǎng)基(Gibco 公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，胰蛋白酶(Gibco 公司)，地塞米松(Sigma 公司)，β - 甘油(Sigma 公司)，抗壞血酸(Sigma 公司)，MTS(Promega 公司)，Annexin V-FITC(Invitrogen 公司)，茜素紅(Amersco 公司)，RT6000 酶標(biāo)分析儀(Rayto 公司)，恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 公司)，倒置相差顯微鏡(Leica 公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur 公司)。

2.不同濃度雙氯芬酸鈉對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、凋亡及成骨分化能力的影響:(1)參照文獻［6］中細(xì)胞分離培養(yǎng)方法:從4 周齡健康雄性SD 大鼠(購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)脛腓骨中提取出骨髓，應(yīng)用全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)BMSCs，傳代分離純化后，進行細(xì)胞表面抗原和成骨、成脂分化能力的鑒定，選取P4 代細(xì)胞。(2)細(xì)胞增殖活性檢測:將消化計數(shù)好的P4 代細(xì)胞分別以每孔1 ×104的密度接種于96 孔板中，加入雙氯芬酸鈉，調(diào)整其終濃度分別為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4mg/L，并設(shè)置空白對照組。每個藥物濃度設(shè)置6個復(fù)孔，放入恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h 后，加入MTS試劑避光孵育2h，酶標(biāo)儀檢測490nm 的吸光度值。(3)細(xì)胞凋亡檢測:將P4 代細(xì)胞以每孔3 ×105的密度接種于6 孔板中，分別加入上述濃度的雙氯芬酸鈉，并設(shè)置空白對照組，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h，消化收集細(xì)胞，并進行計數(shù)，PBS 離心洗滌后，送流式細(xì)胞室Annexin Ⅴ-FITC 法檢測細(xì)胞凋亡情況。(4)細(xì)胞成骨能力檢測:P4 代細(xì)胞以每孔1 ×105的密度接種于6 孔板中，每孔分別加入成骨誘導(dǎo)液(含地塞米松1 ×10-8mol/L、抗壞血酸50μg/ml、β 磷酸甘油10mmol/L)進行成骨誘導(dǎo)，其中5 孔分別加入上述濃度的雙氯芬酸鈉(實驗組)，另1 孔不加雙氯芬酸鈉(對照組)，每3 天換液，培養(yǎng)21天后，倒去上清液，95%冰乙醇固定，加入茜素紅染液，37℃靜置30min，蒸餾水洗滌數(shù)次后，倒置相差顯微鏡觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。

3.不同干預(yù)時間的雙氯芬酸鈉對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響:將P4 代BMSCs 分別以每孔1 ×105的密度接種于6 孔板中，加入成骨誘導(dǎo)液進行成骨誘導(dǎo)，設(shè)置6 個實驗組(1.6mg/L 雙氯芬酸鈉干預(yù))和1 個對照組:A 組:雙氯芬酸鈉干預(yù)第1 ～7 天;B 組:雙氯芬酸鈉干預(yù)第7 ～14 天;C 組:雙氯芬酸鈉干預(yù)第1 ～14 天;D 組:雙氯芬酸鈉干預(yù)第7 ～21天;E 組:雙氯芬酸鈉干預(yù)第14 ～21 天;F 組:藥物干預(yù)第1 ～21 天;對照組:無雙氯芬酸鈉干預(yù)。放入恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 天，進行茜素紅染色(染色步驟同上)，倒置相差顯微鏡觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。

4.統(tǒng)計學(xué)方法:用SPSS 20.0 軟件進行分析，多樣本均值間比較采用方差分析，兩兩比較采用Dunnett - t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.雙氯芬酸鈉對細(xì)胞增殖活性檢測:細(xì)胞培養(yǎng)36h 后，酶標(biāo)分析儀檢測吸光度值，每個藥物濃度取均數(shù)，對照組吸光度值最高，隨著加入雙氯芬酸鈉濃度的增高，吸光度值隨之降低，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，圖1)。

圖1 不同濃度雙氯芬酸鈉對BMSCs 增殖活性抑制情況

2.雙氯芬酸鈉干預(yù)后BMSCs 凋亡率的流式檢測:各實驗組與對照組培養(yǎng)36h 后，流式細(xì)胞儀凋亡檢測顯示，細(xì)胞凋亡率對照組最低，隨著雙氯芬酸鈉藥物濃度的上身，細(xì)胞的凋亡率也隨之增加，各實驗組細(xì)胞凋亡率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，表1)。

3.雙氯芬酸鈉對BMSCs 成骨能力的影響:茜素紅染色結(jié)果可見，對照組可見較多、較大鈣結(jié)節(jié)形成，隨著雙氯芬酸鈉濃度的上升，鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和體積相應(yīng)的變少，藥物濃度為6.4mg/L 時，幾乎無鈣結(jié)節(jié)形成(圖2)。

表1 不同濃度藥物作用36h 后細(xì)胞凋亡率比較(±s)

表1 不同濃度藥物作用36h 后細(xì)胞凋亡率比較(±s)

與對照組相比，* P ＜0.05

組別 36h 細(xì)胞凋亡率(%)6.4mg/L 組 18.82 ±0.69*3.2mg/L 組 16.73 ±0.64*1.6mg/L 組 14.55 ±0.57*0.8mg/L 組 11.76 ±0.67*0.4mg/L 組 9.84 ±0.63*對照組7.59 ±0.74

4.不同干預(yù)時間的雙氯芬酸鈉對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響:各實驗組和對照組分別培養(yǎng)21 天后，茜素紅染色結(jié)果顯示，對照組可見較多鈣結(jié)節(jié)形成;A 組、B 組與D 組3 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量相近，較對照組稍減少，但比C 組和F 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多;E 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量與對照組相似，C 組和F 組鈣結(jié)節(jié)形成相對于對照組數(shù)量最少(圖3)。

圖2 雙氯芬酸鈉干預(yù)成骨分化茜素紅染色(×100)

圖3 不同時段雙氯芬酸鈉干預(yù)成骨分化茜素紅染色(×100)

討 論

NSAIDs 是臨床上廣泛應(yīng)用骨折后、骨折術(shù)后及骨質(zhì)疏松性疼痛的鎮(zhèn)痛的一類藥物。近年來，國內(nèi)外大量的研究報道了NSAIDs 對骨折的愈合存在不利影響，主要作用在骨折愈合的早期階段(BMCSs 在骨折愈合的早期過程發(fā)揮重要作用)，并且影響的程度與藥物濃度和干預(yù)持續(xù)時間明顯相關(guān)。上述研究大多基于全身性或動物研究，也有關(guān)于藥物對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的影響的研究［7，8］。而關(guān)于NSAIDs 對體外培養(yǎng)的BMCSs 直接作用的研究，目前國內(nèi)外報道仍較少。在部分研究中非選擇性NSAIDs 對骨折愈合的影響要遠遠大于選擇性COX -2 抑制劑［9］。雙氯芬酸鈉是一種強效的非選擇性NSAIDs，其解熱、鎮(zhèn)痛作用是阿司匹林的26 ～50 倍，是骨科常用藥物，所以筆者選擇雙氯芬酸鈉作為干預(yù)藥物。根據(jù)相關(guān)文獻的報道以及前期藥物濃度的探索，本實驗雙氯芬酸鈉的藥物濃度定為:6.4、3.2、1.6、0.8、0.4mg/L［10］。本研究經(jīng)過初步探索證明雙氯芬酸鈉對BMSCs 相關(guān)生物學(xué)特性的影響呈明顯的劑量依賴性。隨著藥物濃度的上升，BMSCs 細(xì)胞相對增殖率逐漸明顯下降，細(xì)胞的生長抑制率則逐漸升高。BMSCs 成骨分化能力也隨藥物濃度的升高而下降，成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量也隨之減少。

藥物干預(yù)時間研究的目標(biāo)濃度的確定:當(dāng)藥物濃度較高時細(xì)胞由于增殖抑制較嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡率較高，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的減少，從而影響鈣質(zhì)沉積;當(dāng)藥物濃度較低時，成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量仍然較多;以上兩點均不適合實驗結(jié)果的觀察，因此筆者選擇1.6mg/L 作為干預(yù)濃度。

BMSCs 的成骨分化可分為3 個時期:增殖期，細(xì)胞外間質(zhì)聚集、基質(zhì)沉積期，礦化期［11］。增殖期主要是干細(xì)胞的自我增殖同時開始向成骨細(xì)胞分化，細(xì)胞集落不斷增大至細(xì)胞間相互接觸融合，細(xì)胞開始多層生長，細(xì)胞外間質(zhì)聚集、基質(zhì)沉積進入第2 期，最后鈣鹽沉積為礦化期。本研究選擇第7、14 天為分界點，3個時間段基本處于這3 個時期，有利于觀察藥物作用于細(xì)胞分化的各個階段。通過此次實驗，可以發(fā)現(xiàn)雙氯芬酸鈉對BMSCs 成骨分化的影響主要作用在成骨分化的第一、二兩個階段，在礦化期則無明顯影響，單一的一個階段的藥物干預(yù)，在去除干預(yù)之后，其作用是部分可逆的。說明藥物對BMSCs 的影響與干預(yù)的時間點和干預(yù)的持續(xù)時間相關(guān)，并且短期的藥物作用是部分可逆的。

通過本研究筆者可以初步得出以下結(jié)論，雙氯芬酸鈉對骨折愈合早期的影響主要是通過抑制BMSCs的增殖、促進細(xì)胞凋亡，并且降低細(xì)胞成骨分化能力來實現(xiàn)的，其效應(yīng)呈濃度依賴性和時間依賴性，并且短期的藥物作用效果是部分可逆的，這提示在臨床應(yīng)用NSAIDs 時，要盡量避免在骨折愈合早期階段使用，并減少藥物的用量和使用時間。

1 Williams A. Should non-steroidal antiinflammatory drugs be given to orthopaedic patients with fractures?［J］. Br J Hosp Med:Lond，2007，68 (8):452

2 Krischak GD，Augat P，Blakytny R，et al.The non -steroidal anti -inflammatory drug diclofenac reduces appearance of osteoblasts in bone defect healing in rats［J］. Arch Orthop Trauma Surg 2007，127:453 -458

3 Gerstenfeld LC，Al - Ghawas M，Alkhiary，YM，et al. Selective and nonselective cyclooxygenase-2inhibitors and experimental fracture -healing. Reversibility of effects after short - term treatment［J］. J Bone Joint Surg Am，2007，89:114 -125

4 Simon AM，O'Connor JP. Dose and time - dependent effects of cyclooxygenase-2 inhibition on fracture - healing［J］. J Bone Joint Surg Am，2007，89:500 -511

5 Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］. Science，1999，284(5411):143 -147

6 姚燦，郟舜杰，陳海嘯，等. 確炎舒松對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42(4):38 -41

7 Matziolis G，Rau HM，Klever P，et al.Modification of human osteoblasts by various analgesics［J］. Der Unfallchirurg，2002，105(6):527 -531

8 Karakawa A，F(xiàn)ukawa Y，Okazaki M，et al. Diclofenac sodium inhibits NF - κB transcription in osteoclasts［J］. Journal of Dental Research，2009，88(11):1042 -1047

9 Brown KM，Saunders MM，Kirsch T，et al. Effect of COX-2 -specific inhibition on fracture-healing in the rat femur［J］. The Journal of Bone ＆ Joint Surgery，2004，86(1):116 -123

10 Watters CH，Patterson CC，Mathews HM，et al. Diclofenac sodium for post - tonsillectomy pain in children［J］. Anaesthesia，1988，43(8):641 -643

11 Heiho TJ，Hentunen TA. Differentiation of osteoblasts and osteocytes form mesenchymal stem cell［J］. Curr Stem Cell Res Ther，2008，3(2):131 -145