長白山道地藥材接骨木、苦碟子纖溶酶分離及活性檢測

夏廣清+劉偉+秦佳梅

摘要：從具有活血化瘀功能的長白山道地藥材接骨木、苦碟子中分離纖溶酶，并利用纖維平板法對分離的纖溶酶進(jìn)行活性鑒定。結(jié)果表明：從接骨木和苦碟子中可以分離到具有溶栓活性的纖溶酶，其含量分別為1842μg/g及1976μg/g。尿激酶法測定其比活力分別為0.795U及0.837U，SDS-PAGE電泳檢測其大小約為36ku，該酶在高溫下失活，在70%～90%硫酸銨飽和溶液中活性最高。

關(guān)鍵詞：接骨木；苦碟子；纖溶酶；分離；活性檢測

中圖分類號：S567.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0315-02

心腦血管疾病是危害人類健康的主要疾病之一。近30年來，我國人群心血管疾病的發(fā)病率及危險因素水平呈不斷上升趨勢。據(jù)衛(wèi)生部心血管病防治中心發(fā)布的《中國心血管疾病調(diào)查報告2011》：目前，我國包括冠心病、腦中風(fēng)、心力衰竭和高血壓在內(nèi)的心血管病病人估計(jì)已達(dá)2.3億[1-2]。因此研發(fā)高效、特異、安全、副作用小的溶栓藥物，一直是近年來醫(yī)藥界的熱門課題[3]。隨著對中醫(yī)藥認(rèn)識的發(fā)展，溶栓中草藥的研究也在不斷發(fā)展，已有部分中藥被制成了單味注射液，如刺五加、川芍、丹參、燈盞花、葛根素、紅花等[4]；同時，一些學(xué)者也在不斷研究新的溶栓藥用植物。接骨木、苦碟子作為長白山道地藥材，具有祛風(fēng)、活血，治風(fēng)濕筋骨疼痛，抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松及免疫活性等藥理作用[5-6]，但有關(guān)其在溶栓方面的研究尚未見相關(guān)報道。因此本研究以長白山道地藥材接骨木、苦碟子為試驗(yàn)材料，采用硫酸銨沉淀，透析除去小分子物質(zhì)，用纖維平板法初步判斷接骨木、苦碟子粗提物中的溶纖成分，并對其活性做初步研究，為進(jìn)一步開發(fā)具有溶栓功能的長白山道地藥材提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1中草藥接骨木、苦碟子采自通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)基地，經(jīng)生命科學(xué)學(xué)院秦佳梅教授鑒定。

1.1.2主要試劑纖維蛋白原、纖維蛋白溶酶原、凝血酶購自中國藥品生物制品檢定所，標(biāo)準(zhǔn)尿激酶、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶購自天津生物化學(xué)制藥廠。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1接骨木、苦碟子蛋白質(zhì)的提取

稱取接骨木、苦碟子干粉2g，浸于200mLPBS緩沖液中，4℃保存過夜，間隔時間振蕩，離心（4℃，4000r/min）10min，取上清，加入80%飽和硫酸銨溶液，離心（4℃，8000r/min）10min，沉淀用PBS溶解，得到蛋白粗提液，裝入透析袋用PBS緩沖液透析，每隔2h換1次溶液，取透析后的蛋白溶液冷凍干燥，-80℃冰箱中保存，備用。

1.2.2樣品蛋白提取物濃度的測定

采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）法[7]測定蛋白質(zhì)含量：取待測粗酶蛋白樣品溶液0.1mL，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)溶液，測定595nm處吸光度，計(jì)算供試樣品的蛋白濃度。

1.2.3蛋白提取物的體外纖溶活性鑒定

纖維平板的配制及尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參照夏廣清等的方法[8]。

1.2.3.1判斷纖溶成分是否為蛋白質(zhì)

將供試品在沸水浴中加熱10min，點(diǎn)纖維蛋白板，若活性喪失，可初步判斷起溶纖作用的物質(zhì)為蛋白質(zhì)。

1.2.3.2樣品蛋白溶液酶活力測定

分別取10μL接骨木、苦碟子蛋白質(zhì)提取液，加入纖維平板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，觀察，如點(diǎn)樣孔周圍出現(xiàn)透明的溶圈，則證明被加樣品有溶栓效果，測量溶圈直徑，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到樣品溶液相對尿激酶活力。

1.2.3.3蛋白提取物的溶纖比活力測定

蛋白比活力（U/mg）=相對尿激酶活力（U）/[蛋白濃度（mg/mL）×點(diǎn)樣體積（mL）]。

1.2.4接骨木、苦碟子纖溶酶的SDS-PAGE檢測

按汪家政等的方法[9]，對蛋白質(zhì)進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測，考馬斯亮藍(lán)G-250染色。

2結(jié)果與分析

2.1接骨木、苦碟子粗酶提取液蛋白質(zhì)含量的測定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的吸光度，繪制蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算公式為：y=0.0074x-0.0102。依據(jù)公式通過吸光度測得接骨木、苦碟子粗酶蛋白含量分別為1842μg/g及1976μg/g。

2.2接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鑒定及溶纖活力、比活力

根據(jù)尿激酶溶圈直徑的平方繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖

2），由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到酶活力計(jì)算公式為y=0.0102x+0.032。根據(jù)公式，由樣品蛋白在纖維平板上的溶圈直徑計(jì)算出接骨木及苦碟子粗提物蛋白比活力為分別0.795U及0.837U。

2.3接骨木、苦碟子粗酶提取物硫酸銨分級沉淀及體外溶栓試驗(yàn)

由圖3-A可見，從接骨木、苦碟子中可以分離出具有溶纖活性的纖溶蛋白。硫酸銨沉淀試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨飽和度在0～40%時，沉淀物無纖溶活性；當(dāng)硫酸銨飽和度在50%～60%時，沉淀物活性較低；而當(dāng)硫酸銨飽和度為70%～90%，沉淀物活性最高（圖3-B），因此，后續(xù)試驗(yàn)均采取70%～90%飽和硫酸銨沉淀。

2.4接骨木、苦碟子粗酶提取物蛋白成分鑒定

將提取到的接骨木、苦碟子粗酶提取物在沸水中煮沸5min，將煮沸后的樣品進(jìn)行溶纖試驗(yàn)，纖維平板上未見任何溶解現(xiàn)象，表明接骨木、苦碟子中具有溶栓作用的為蛋白質(zhì)。

2.5接骨木、苦碟子纖溶酶的SDS-PAGE檢測

對得到的接骨木、苦碟子粗酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，從這2種長白山道地藥材中可分離到分子量為15～45ku的蛋白質(zhì)（圖4），經(jīng)離子交換層析后，得到分子量大約為36ku的明顯條帶（圖5），因此，初步判斷接骨木、苦碟子纖溶蛋白酶的分子量大約為36ku。endprint

3討論

隨著人們生活水平的不斷提高，血栓性疾病已成為常見病、多發(fā)病，尤其是心腦血管疾病，嚴(yán)重影響人類的健康和壽命。目前預(yù)防和治療血栓性疾病主要有3種方式：一是針對一些有高凝狀態(tài)的病人用藥物預(yù)防血栓；二是對已有血栓形成的患者給予抗凝治療，以防止血栓的延伸、擴(kuò)大，避免栓塞并發(fā)癥；三是采用手術(shù)或服用溶栓藥物，消除血栓，疏通血管，恢復(fù)正常血液流動，減少組織和臟器的損傷。前2種方式對于已經(jīng)形成的血栓無法消除，而手術(shù)取血栓技術(shù)的難度和風(fēng)險都較大，所以在臨床上多采用溶栓藥物法。溶栓藥物以溶解纖維蛋白多聚體為主，使血栓纖維蛋白降解，形成可溶性的纖維蛋白降解產(chǎn)物，及時使血管再通，減輕臟器損害的范圍和程度，大大提高病人的存活率。纖溶系統(tǒng)對纖維蛋白的溶解、對血液的循環(huán)有重要的影響，纖溶酶活性的降低是導(dǎo)致血栓形成的主要原因之一。目前纖溶酶主要來源于動物和微生物，源于植物的纖溶酶很少[10]。本試驗(yàn)從接骨木、苦碟子中分離得到纖溶酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，表明可以從接骨木、苦碟子中分離出分子量約為36ku的具有溶栓活性的纖溶酶，有望將其開發(fā)成新型的溶栓類藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1347-1348.

[2]鄭紅花，羅德生，羅麗芳，等.大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷時山梨醇脫氫酸SOD活性及MDA含量變化[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，14（4）：232-234.

[3]顧毅，時德，趙渝.腫瘤與靜脈血栓形成的關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國癌癥雜志，2002，12（1）：85-88.

[4]何葉喧.中草藥牛膝、茜草纖溶酶的篩選與分離純化[D].保定：河北大學(xué)，2006.

[5]歐陽富，劉遠(yuǎn)，肖輝輝，等.接骨木中木脂素類化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2009，3（10）：1225-1227.

[6]秦岐行.苦碟子治療心血管疾病活性成分篩選[D].長春：長春理工大學(xué)，2012.

[7]肖能庚，余瑞元，袁明秀，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].2版.北京：北京大學(xué)出版社，2005：262-270.

[8]夏廣清，宋金枝，劉偉.穿龍薯蕷纖溶酶分離及活性檢測[J].通化師范學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)，2013，34（2）：42-43，86.

[9]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2000.

[10]顧昌玲，朱寶成，周艷芬，等.延胡索纖溶酶的分離純化及部分性質(zhì)[J].中國生化藥物雜志，2008，29（2）：81-84，88.endprint

3討論

隨著人們生活水平的不斷提高，血栓性疾病已成為常見病、多發(fā)病，尤其是心腦血管疾病，嚴(yán)重影響人類的健康和壽命。目前預(yù)防和治療血栓性疾病主要有3種方式：一是針對一些有高凝狀態(tài)的病人用藥物預(yù)防血栓；二是對已有血栓形成的患者給予抗凝治療，以防止血栓的延伸、擴(kuò)大，避免栓塞并發(fā)癥；三是采用手術(shù)或服用溶栓藥物，消除血栓，疏通血管，恢復(fù)正常血液流動，減少組織和臟器的損傷。前2種方式對于已經(jīng)形成的血栓無法消除，而手術(shù)取血栓技術(shù)的難度和風(fēng)險都較大，所以在臨床上多采用溶栓藥物法。溶栓藥物以溶解纖維蛋白多聚體為主，使血栓纖維蛋白降解，形成可溶性的纖維蛋白降解產(chǎn)物，及時使血管再通，減輕臟器損害的范圍和程度，大大提高病人的存活率。纖溶系統(tǒng)對纖維蛋白的溶解、對血液的循環(huán)有重要的影響，纖溶酶活性的降低是導(dǎo)致血栓形成的主要原因之一。目前纖溶酶主要來源于動物和微生物，源于植物的纖溶酶很少[10]。本試驗(yàn)從接骨木、苦碟子中分離得到纖溶酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，表明可以從接骨木、苦碟子中分離出分子量約為36ku的具有溶栓活性的纖溶酶，有望將其開發(fā)成新型的溶栓類藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1347-1348.

[2]鄭紅花，羅德生，羅麗芳，等.大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷時山梨醇脫氫酸SOD活性及MDA含量變化[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，14（4）：232-234.

[3]顧毅，時德，趙渝.腫瘤與靜脈血栓形成的關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國癌癥雜志，2002，12（1）：85-88.

[4]何葉喧.中草藥牛膝、茜草纖溶酶的篩選與分離純化[D].保定：河北大學(xué)，2006.

[5]歐陽富，劉遠(yuǎn)，肖輝輝，等.接骨木中木脂素類化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2009，3（10）：1225-1227.

[6]秦岐行.苦碟子治療心血管疾病活性成分篩選[D].長春：長春理工大學(xué)，2012.

[7]肖能庚，余瑞元，袁明秀，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].2版.北京：北京大學(xué)出版社，2005：262-270.

[8]夏廣清，宋金枝，劉偉.穿龍薯蕷纖溶酶分離及活性檢測[J].通化師范學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)，2013，34（2）：42-43，86.

[9]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2000.

[10]顧昌玲，朱寶成，周艷芬，等.延胡索纖溶酶的分離純化及部分性質(zhì)[J].中國生化藥物雜志，2008，29（2）：81-84，88.endprint

3討論

隨著人們生活水平的不斷提高，血栓性疾病已成為常見病、多發(fā)病，尤其是心腦血管疾病，嚴(yán)重影響人類的健康和壽命。目前預(yù)防和治療血栓性疾病主要有3種方式：一是針對一些有高凝狀態(tài)的病人用藥物預(yù)防血栓；二是對已有血栓形成的患者給予抗凝治療，以防止血栓的延伸、擴(kuò)大，避免栓塞并發(fā)癥；三是采用手術(shù)或服用溶栓藥物，消除血栓，疏通血管，恢復(fù)正常血液流動，減少組織和臟器的損傷。前2種方式對于已經(jīng)形成的血栓無法消除，而手術(shù)取血栓技術(shù)的難度和風(fēng)險都較大，所以在臨床上多采用溶栓藥物法。溶栓藥物以溶解纖維蛋白多聚體為主，使血栓纖維蛋白降解，形成可溶性的纖維蛋白降解產(chǎn)物，及時使血管再通，減輕臟器損害的范圍和程度，大大提高病人的存活率。纖溶系統(tǒng)對纖維蛋白的溶解、對血液的循環(huán)有重要的影響，纖溶酶活性的降低是導(dǎo)致血栓形成的主要原因之一。目前纖溶酶主要來源于動物和微生物，源于植物的纖溶酶很少[10]。本試驗(yàn)從接骨木、苦碟子中分離得到纖溶酶并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，表明可以從接骨木、苦碟子中分離出分子量約為36ku的具有溶栓活性的纖溶酶，有望將其開發(fā)成新型的溶栓類藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1347-1348.

[2]鄭紅花，羅德生，羅麗芳，等.大鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷時山梨醇脫氫酸SOD活性及MDA含量變化[J].咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2000，14（4）：232-234.

[3]顧毅，時德，趙渝.腫瘤與靜脈血栓形成的關(guān)系研究進(jìn)展[J].中國癌癥雜志，2002，12（1）：85-88.

[4]何葉喧.中草藥牛膝、茜草纖溶酶的篩選與分離純化[D].保定：河北大學(xué)，2006.

[5]歐陽富，劉遠(yuǎn)，肖輝輝，等.接骨木中木脂素類化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2009，3（10）：1225-1227.

[6]秦岐行.苦碟子治療心血管疾病活性成分篩選[D].長春：長春理工大學(xué)，2012.

[7]肖能庚，余瑞元，袁明秀，等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M].2版.北京：北京大學(xué)出版社，2005：262-270.

[8]夏廣清，宋金枝，劉偉.穿龍薯蕷纖溶酶分離及活性檢測[J].通化師范學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)，2013，34（2）：42-43，86.

[9]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2000.

[10]顧昌玲，朱寶成，周艷芬，等.延胡索纖溶酶的分離純化及部分性質(zhì)[J].中國生化藥物雜志，2008，29（2）：81-84，88.endprint