藥用植物湖北羅田蒼術(shù)亞種的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程

段院生+朱斌+舒少華+王沫

摘要：藥用植物湖北羅田蒼術(shù)因其特有的形態(tài)和地理分布被劃分為一個(gè)新亞種。對(duì)羅田蒼術(shù)的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明，染色體（2n=24）正常配對(duì)與分離，沒有出現(xiàn)未配對(duì)染色體，在2次分裂后期和末期沒有落后染色體及形成微核，最后產(chǎn)生較高比例的可育花粉。研究結(jié)果為羅田蒼術(shù)的較高結(jié)實(shí)率及種子的高成活率提供了細(xì)胞學(xué)解釋。

關(guān)鍵詞：蒼術(shù)；減數(shù)分裂；花粉母細(xì)胞；繁殖方式；花粉育性

中圖分類號(hào)：S567.23+9.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0273-02

藥用植物蒼術(shù)（Atractylodeslancea）為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，分布并栽培于我國(guó)的許多地區(qū)，收獲其根狀莖干燥后作藥用。根莖含揮發(fā)油，主要成分為茅術(shù)醇、桉葉油醇、蒼術(shù)酮等；可制成祛濕藥、健脾藥、解表藥，主治濕困脾胃、胞痞腹脹、食欲不振、嘔吐泄瀉、濕腫、夜盲等癥。湖北省羅田和英山一帶的蒼術(shù)植株、葉、頭狀花序及花的各部均較大，與其他地區(qū)的蒼術(shù)有明顯的形態(tài)和地理分布差異，羅田蒼術(shù)含豐富的揮發(fā)油，含量比其他產(chǎn)地的高，因此被分為一個(gè)新亞種（Atractylodeslanceassp.luotianensis）[1]。羅田蒼術(shù)的特征是根狀莖香味濃郁、橫斷面有橙黃色或棕紅色油點(diǎn)，俗稱“珠砂點(diǎn)”，于2011年獲中國(guó)地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。近期細(xì)胞學(xué)研究表明，該地區(qū)蒼術(shù)的染色體數(shù)為2n=24，與其他地區(qū)的相同，但只有1對(duì)染色體的短臂上出現(xiàn)隨體[2]，相關(guān)報(bào)道表明，相同染色體數(shù)的蒼術(shù)均有2對(duì)染色體帶有隨體[3-4]。另用熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)，在羅田蒼術(shù)的染色體上檢測(cè)到1對(duì)染色體帶有5SrDNA位點(diǎn)，另外2對(duì)染色體帶有45SrDNA位點(diǎn)，其中1對(duì)為隨體染色體[2]。故1對(duì)染色體上的45SrDNA位點(diǎn)沒有表達(dá)，沒有隨體的形成。因此，羅田地區(qū)的蒼術(shù)可能在占據(jù)該地區(qū)后發(fā)生了染色體水平上的分化，為其亞種的分類地位提供了細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

由于蒼術(shù)產(chǎn)生兩性花或單性花，兩者多異株，單性花一般為雌花；兩性花植株具有一定結(jié)實(shí)率而產(chǎn)生種子。蒼術(shù)的繁殖方法有種子繁殖、分株繁殖、根莖繁殖，但僅兩性花產(chǎn)生種子，且種子成熟后易霉?fàn)€，致使種子繁殖較困難。鑒于羅田蒼術(shù)較其他蒼術(shù)有不同的形態(tài)及細(xì)胞學(xué)特征，本研究觀察了花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程，為羅田蒼術(shù)繁殖方式提供細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

1材料與方法

1.1材料制備

蒼術(shù)花序采自湖北省英山縣陶家河鄉(xiāng)。在7月蒼術(shù)的初花期，上午在地里辨認(rèn)兩性花植株，將花序取下直接投入準(zhǔn)備好的固定液中（95%乙醇∶冰醋酸=3∶1），帶回武漢換入新鮮固定液，放置過(guò)夜，次日將固定的材料轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中置于4℃的冰箱中備用。

1.2細(xì)胞學(xué)觀察

觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，將固定的花序用自來(lái)水洗去乙醇后，用解剖針挑出不同時(shí)期的花藥，放于盛1mol/L鹽酸溶液的小杯中，于60℃水浴鍋中酸解3min；將花藥置于清潔載玻片中央的1小滴水中，用解剖針搗碎并挑除大塊花藥壁雜質(zhì)，加1滴卡寶品紅染色液染色，取干凈的蓋玻片蓋上，用濾紙包住蓋片，用手指輕輕擠壓蓋片除去多余的染色液，并使細(xì)胞散開。然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞學(xué)制片，辨認(rèn)細(xì)胞分裂的時(shí)期，將合適及清晰的細(xì)胞圖像儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中供分析。

1.3花粉育性觀察

觀察花粉育性時(shí)，在晴天采當(dāng)天開放的花朵，用鑷子取出花藥置于載玻片上，加1滴醋酸洋紅染色液，用鑷子擠壓出花粉粒并去除藥壁組織后，蓋上蓋玻片，用濾紙包住蓋片并用手指輕輕擠壓蓋片除去多余的染色液，在光學(xué)顯微鏡下觀察。可育的花粉大而圓并能著色，不育花粉小而癟并不能著色。每個(gè)單株觀察200～300個(gè)花粉粒。

2結(jié)果與分析

2.1取材時(shí)間及方式

因蒼術(shù)的兩性花與單性雌花多異株，要在開花后才能在群體中分辨出兩性花植株，取其花序固定觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂。蒼術(shù)為頭狀花序，單個(gè)花蕾很小，特別是處于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期的花蕾更小。固定的未開放的不同大小的花序中，處于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期的花序比例較小，有時(shí)即使很小的花序里面的花藥都已產(chǎn)生花粉。要從大量固定的花序中才能挑選到合適的花藥，觀察到減數(shù)分裂的全過(guò)程。表明蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂在花序與花發(fā)育的較早時(shí)期進(jìn)行，始花時(shí)1株蒼術(shù)上大多數(shù)花序的分裂高峰已過(guò)。較理想的取材方式為在第1年鑒定出兩性花植株，第2年將其無(wú)性繁殖，在未開花前取幼小的花序固定。

2.2花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程

在第1次減數(shù)分裂的前期I，細(xì)線期花粉母細(xì)胞（pollenmothercells，PMCs）的細(xì)胞輪廓清晰可見，呈圓形或卵園形，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，染色體呈一團(tuán)細(xì)線纏繞在一起，只在線團(tuán)的邊緣可見向外伸展的單條染色體，僅占據(jù)細(xì)胞的較小體積（圖1-a）；但在少部分細(xì)胞中，除大的染色體團(tuán)外，還觀察到1至數(shù)個(gè)染色較深、體積小很多的染色團(tuán)，從染色特性及形態(tài)判斷不是外來(lái)的雜質(zhì)，而可能是染色質(zhì)，這些額外染色質(zhì)的來(lái)源可能是PMCs間的細(xì)胞融合（cytomixis）時(shí)發(fā)生的染色質(zhì)穿壁，使其他細(xì)胞的部分染色體轉(zhuǎn)移過(guò)來(lái)。這種現(xiàn)象在某些植物的減數(shù)分裂過(guò)程中已有報(bào)道，可引起群體中染色體數(shù)目的變異[5-6]。該結(jié)果為蒼術(shù)種間與種內(nèi)的染色體數(shù)目變異提供了解釋，在蒼術(shù)中常觀察到非整倍體的細(xì)胞[2-3]。在偶線期，染色體變粗，分布在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)（圖1-b）；但未能觀察到染色體形態(tài)理想的粗線期PMCs。在雙線期及終變期PMCs內(nèi)，染色體變得粗短，可見多數(shù)染色體并排成對(duì)出現(xiàn)，沒有明顯的交叉結(jié)；只在較大的染色體對(duì)（二價(jià)體）間可見明顯的交叉結(jié)，可區(qū)分每個(gè)二價(jià)體，計(jì)數(shù)有12個(gè)二價(jià)體（圖1-c）；在中期I時(shí)，二價(jià)體排列在細(xì)胞中央，二價(jià)體中每條染色體定向細(xì)胞兩極，可見較小二價(jià)體的2條染色體已分開但仍有染色質(zhì)絲相聯(lián)，而較大二價(jià)體的2條染色體還由末端交叉結(jié)連接（圖1-d）；在后期與末期I時(shí)，染色體達(dá)到兩極后形成2個(gè)子細(xì)胞（圖1-e），但沒有細(xì)胞質(zhì)分裂而進(jìn)入第2次減數(shù)分裂。在顯微鏡下較難區(qū)分后期/末期I與前期IIPMCs。在中期II，在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)染色體分兩組呈一字形排列（圖1-f）；在后期/末期II，染色體分裂后產(chǎn)生4個(gè)子核/子細(xì)胞，細(xì)胞外的胼胝質(zhì)壁出現(xiàn)（圖1-g）；最后由4個(gè)子細(xì)胞發(fā)育成花粉粒（圖1-h）。花粉的可染率（可育率）為93.7%。故蒼術(shù)表現(xiàn)的是同時(shí)型小孢子發(fā)生，即在減數(shù)分裂的2次分裂中細(xì)胞質(zhì)只分裂1次，且具有3孔花粉（圖1-g）。染色體間的長(zhǎng)短差異顯著，與染色體核型分析結(jié)果一致，最長(zhǎng)染色體與最短染色體的長(zhǎng)度比超過(guò)2∶1[2]（圖1-i）。endprint

3討論

在觀察的材料中，蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中沒有出現(xiàn)染色體落后及微核，顯示正常的染色體配對(duì)與分離，最后產(chǎn)生較高可育的花粉。為蒼術(shù)的較高結(jié)實(shí)率提供了細(xì)胞學(xué)解釋。正常的減數(shù)分裂也保證了蒼術(shù)染色體數(shù)目的穩(wěn)定，因蒼術(shù)屬所有種（包括白術(shù)，AatractylodesmacrocehpalaKoidz）和亞種的染色體數(shù)都為2n=24[2-4]。少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)的其他染色體數(shù)的原因有待進(jìn)一步研究。

蒼術(shù)在自然條件下通過(guò)根莖無(wú)性繁殖，但同時(shí)仍進(jìn)行較正常的種子繁殖。這與天南星科的半夏（Pinelliaternata）有明顯差別，因其以珠芽和塊莖繁殖的無(wú)性繁殖為主，因種子結(jié)實(shí)率低及種子發(fā)芽差而有性繁殖退化。細(xì)胞學(xué)觀察表明，染色體數(shù)變化較大的多倍體系列群體，減數(shù)分裂過(guò)程常出現(xiàn)不配對(duì)染色體、落后染色體及微核，導(dǎo)致花粉育性很低[5]。三百草科的魚腥草（Houttuyniacordata）也是多倍體系列，主要以地下莖繁殖；花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中發(fā)生高頻率的細(xì)胞融合及異常，花粉育性極低；但可能由孤雌生殖產(chǎn)生較多種子，且種子萌發(fā)好[6]。蒼術(shù)為二倍體物種（2n=2x=24），不能忍耐染色體數(shù)的變化，至少羅田一帶蒼術(shù)的有性生殖還未退化，而其他蒼術(shù)的減數(shù)分裂過(guò)程還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]胡世林，馮學(xué)鋒，王玠，等.中國(guó)蒼術(shù)屬一新亞種[J].植物分類學(xué)報(bào)，2001，39（1）：84-86.

[2]王臣，邢秀芳，王宗霞，等.東北產(chǎn)蒼術(shù)屬植物的細(xì)胞學(xué)研究[J].植物研究，1997，17（1）：79-84，128.

[3]李俊英，李茂輝.東北蒼術(shù)屬三種主要核型的研究[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，19（4）：58-61.

[4]葛傳吉，李巖坤，周月，等.白術(shù)染色體核型分析[J].云南植物研究，1987，9（1）：116-118.

[5]LiuY，HuiRK，DengRN，etal.AbnormalmalemeiosisexplainspollensterilityinthepolyploidmedicinalplantPinelliaternata（Araceae）[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：112-120.

[6]GuanJZ，WangJJ，ChengZH，etal.CytomixisandmeioticabnormalitiesduringmicrosporogenesisareresponsibleformalesterilityandchromosomevariationsinHouttuyniacordata[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：121-130.endprint

3討論

在觀察的材料中，蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中沒有出現(xiàn)染色體落后及微核，顯示正常的染色體配對(duì)與分離，最后產(chǎn)生較高可育的花粉。為蒼術(shù)的較高結(jié)實(shí)率提供了細(xì)胞學(xué)解釋。正常的減數(shù)分裂也保證了蒼術(shù)染色體數(shù)目的穩(wěn)定，因蒼術(shù)屬所有種（包括白術(shù)，AatractylodesmacrocehpalaKoidz）和亞種的染色體數(shù)都為2n=24[2-4]。少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)的其他染色體數(shù)的原因有待進(jìn)一步研究。

蒼術(shù)在自然條件下通過(guò)根莖無(wú)性繁殖，但同時(shí)仍進(jìn)行較正常的種子繁殖。這與天南星科的半夏（Pinelliaternata）有明顯差別，因其以珠芽和塊莖繁殖的無(wú)性繁殖為主，因種子結(jié)實(shí)率低及種子發(fā)芽差而有性繁殖退化。細(xì)胞學(xué)觀察表明，染色體數(shù)變化較大的多倍體系列群體，減數(shù)分裂過(guò)程常出現(xiàn)不配對(duì)染色體、落后染色體及微核，導(dǎo)致花粉育性很低[5]。三百草科的魚腥草（Houttuyniacordata）也是多倍體系列，主要以地下莖繁殖；花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中發(fā)生高頻率的細(xì)胞融合及異常，花粉育性極低；但可能由孤雌生殖產(chǎn)生較多種子，且種子萌發(fā)好[6]。蒼術(shù)為二倍體物種（2n=2x=24），不能忍耐染色體數(shù)的變化，至少羅田一帶蒼術(shù)的有性生殖還未退化，而其他蒼術(shù)的減數(shù)分裂過(guò)程還有待進(jìn)一步研究。

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[4]葛傳吉，李巖坤，周月，等.白術(shù)染色體核型分析[J].云南植物研究，1987，9（1）：116-118.

[5]LiuY，HuiRK，DengRN，etal.AbnormalmalemeiosisexplainspollensterilityinthepolyploidmedicinalplantPinelliaternata（Araceae）[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：112-120.

[6]GuanJZ，WangJJ，ChengZH，etal.CytomixisandmeioticabnormalitiesduringmicrosporogenesisareresponsibleformalesterilityandchromosomevariationsinHouttuyniacordata[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：121-130.endprint

3討論

在觀察的材料中，蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中沒有出現(xiàn)染色體落后及微核，顯示正常的染色體配對(duì)與分離，最后產(chǎn)生較高可育的花粉。為蒼術(shù)的較高結(jié)實(shí)率提供了細(xì)胞學(xué)解釋。正常的減數(shù)分裂也保證了蒼術(shù)染色體數(shù)目的穩(wěn)定，因蒼術(shù)屬所有種（包括白術(shù)，AatractylodesmacrocehpalaKoidz）和亞種的染色體數(shù)都為2n=24[2-4]。少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)的其他染色體數(shù)的原因有待進(jìn)一步研究。

蒼術(shù)在自然條件下通過(guò)根莖無(wú)性繁殖，但同時(shí)仍進(jìn)行較正常的種子繁殖。這與天南星科的半夏（Pinelliaternata）有明顯差別，因其以珠芽和塊莖繁殖的無(wú)性繁殖為主，因種子結(jié)實(shí)率低及種子發(fā)芽差而有性繁殖退化。細(xì)胞學(xué)觀察表明，染色體數(shù)變化較大的多倍體系列群體，減數(shù)分裂過(guò)程常出現(xiàn)不配對(duì)染色體、落后染色體及微核，導(dǎo)致花粉育性很低[5]。三百草科的魚腥草（Houttuyniacordata）也是多倍體系列，主要以地下莖繁殖；花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中發(fā)生高頻率的細(xì)胞融合及異常，花粉育性極低；但可能由孤雌生殖產(chǎn)生較多種子，且種子萌發(fā)好[6]。蒼術(shù)為二倍體物種（2n=2x=24），不能忍耐染色體數(shù)的變化，至少羅田一帶蒼術(shù)的有性生殖還未退化，而其他蒼術(shù)的減數(shù)分裂過(guò)程還有待進(jìn)一步研究。

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[3]李俊英，李茂輝.東北蒼術(shù)屬三種主要核型的研究[J].沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1988，19（4）：58-61.

[4]葛傳吉，李巖坤，周月，等.白術(shù)染色體核型分析[J].云南植物研究，1987，9（1）：116-118.

[5]LiuY，HuiRK，DengRN，etal.AbnormalmalemeiosisexplainspollensterilityinthepolyploidmedicinalplantPinelliaternata（Araceae）[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：112-120.

[6]GuanJZ，WangJJ，ChengZH，etal.CytomixisandmeioticabnormalitiesduringmicrosporogenesisareresponsibleformalesterilityandchromosomevariationsinHouttuyniacordata[J].GeneticsandMolecularResearch，2012，11（1）：121-130.endprint