鐵皮石斛離體快繁技術

余樂+蘭芹英+姜宗慶

摘要：以鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）為研究對象，通過對不同無機鹽濃度、不同培養(yǎng)溫度以及不同激素濃度配比等影響因子進行研究，確立以種子無菌萌發(fā)為途徑的鐵皮石斛組培快繁體系。結果表明：25℃時，1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA培養(yǎng)基配方最有利于鐵皮石斛原球莖的誘導和幼苗分化；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基配方最適合鐵皮石斛幼苗生根，生根率達100%。

關鍵詞：鐵皮石斛；種子；離體快繁；優(yōu)化培養(yǎng)基配方

中圖分類號：S567.23+9.04文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0268-02

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraetMigo）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生型草本植物，別稱黑節(jié)草、鐵皮蘭，是我國特有的名貴藥材[1-3]。此外，鐵皮石斛亦有“救命仙草”“寸金草”之稱[4]，《道臧》將其譽為“中華九大仙草之首”。近年來，由于人們對石斛生存環(huán)境的過度破壞，野生石斛長期處于被濫采濫挖的狀態(tài)；加上石斛自然繁殖困難，種子萌發(fā)率低，而傳統(tǒng)繁殖又較為緩慢，現(xiàn)在已經(jīng)很難發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛的蹤跡[5-10]，因而藥用石斛市場供需矛盾也就日益凸顯出來[11-12]。本研究以鐵皮石斛成熟種子為外植體，通過對不同無機鹽濃度、不同培養(yǎng)溫度以及不同激素濃度配比等問題的探討，以期建立鐵皮石斛離體快繁技術體系，從而為鐵皮石斛工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)與技術指導，對野生石斛的種質資源保護也具有重要意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用鐵皮石斛成熟種子由泰州森禾花卉園藝有限公司花木基地提供。

1.2試驗方法

1.2.1種子無菌萌發(fā)（1）培養(yǎng)基種類對種子萌發(fā)的影響試驗：設KC、1/2MS、1/4MS、MS等4種培養(yǎng)基，均添加2%蔗糖、0.6%瓊脂、20%馬鈴薯汁，調節(jié)pH值為5.6～5.8，培養(yǎng)溫度為25℃，光照度2000lx，光照時間12h/d，環(huán)境濕度60%～70%。（2）培養(yǎng)溫度對種子萌發(fā)的影響試驗：設15～30℃和25/30℃變溫處理，培養(yǎng)基配方為1/2MS+2%蔗糖+0.6%瓊脂+20%馬鈴薯汁，pH值5.6～5.8，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照度為2000lx，光照時間為12h/d，環(huán)境濕度60%～70%。12瓶為1組，每組3個重復，30d為1個周期，觀察并統(tǒng)計種子萌發(fā)、原球莖的生長情況，選出最適宜鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)的基礎培養(yǎng)基。

1.2.2原球莖增殖與分化研究不同激素濃度配比對鐵皮石斛原球莖增殖與分化的影響，培養(yǎng)基配方為：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+2%蔗糖+0.6%瓊脂+20%馬鈴薯汁。調節(jié)pH值至5.6～5.8，放置于（25±1）℃、光照度2000lx，光照時間12h/d、環(huán)境濕度60%～70%的條件下培養(yǎng)。12瓶為1組，每組3個重復，60d為1個周期，觀察并統(tǒng)計原球莖增殖與分化情況，從中選出最適宜鐵皮石斛原球莖增殖與分化的培養(yǎng)基。

1.2.3幼苗壯苗生根培養(yǎng)將生長良好的鐵皮石斛組培苗接入配方為MS+0.1～1.0mg/LNAA+2%蔗糖+0.6%瓊脂+20%馬鈴薯汁的培養(yǎng)基中。調節(jié)pH值為5.6～5.8，放置于（25±1）℃、光照度2000lx、光照時間12h/d、環(huán)境濕度60%～70%的條件下培養(yǎng)。12瓶為1組，每組3個重復，60d為1個周期，觀察并統(tǒng)計鐵皮石斛幼苗壯苗的生根情況，篩選出適合鐵皮石斛幼苗壯苗生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。

1.2.4煉苗移栽將生長良好、根系發(fā)達的鐵皮石斛組培苗于常溫下煉苗3～5d后移栽至日光溫室中。培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，環(huán)境濕度70%～80%。栽培基質為泥炭土、碎樹皮，栽培容器為無紡布袋、塑料花盆。以50株苗為1組，每組3個重復，60d為1個周期，篩選出適合鐵皮石斛組培苗的栽培環(huán)境。

2結果與分析

2.1種子無菌萌發(fā)

2.1.1基本培養(yǎng)基的篩選由表1可以看出，鐵皮石斛種子在4種基本培養(yǎng)基中均能萌發(fā)，但原球莖誘導效果存在差異。以1/2MS最好，1/4MS次之，MS的誘導效果最差；鐵皮石斛種子在1/2MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間較短，且萌發(fā)整齊，原球莖誘導率高達91.1%。實際觀察發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基上的原球莖呈鮮綠色，且粒大。綜合考慮原球莖的誘導率和生長勢，1/2MS培養(yǎng)基是最適合鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)的基礎培養(yǎng)基。

2.1.2溫度對種子萌發(fā)的影響由表2可以看出，在15℃培養(yǎng)30d后，鐵皮石斛種子沒有發(fā)生變化；在20℃條件下培養(yǎng)的種子，原球莖體積較小，呈嫩綠色，誘導時間比25℃、30℃和25/30℃變溫培養(yǎng)條件的長；25℃條件下的種子萌發(fā)整齊一致，原球莖呈綠色，且粒大。綜上分析可知，25℃較適合鐵皮石斛種子的無菌萌發(fā)。

2.2原球莖增殖與分化

植物生長調節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關鍵物質，在鐵皮石斛組培快繁過程中作用明顯。將種子萌發(fā)后誘導出的原球莖接入培養(yǎng)基中，60d后觀察統(tǒng)計。表3結果表明，即使不添加任何激素，原球莖也能增殖，但增殖系數(shù)最低，增殖情況最差；適當濃度的激素配比有利于原球莖的增殖，以添加1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA激素濃度組合的增殖效果最好，增殖系數(shù)達到10.2，原球莖呈綠色，簇生，增殖趨勢明顯。

將已增殖的原球莖接入到誘導分化的培養(yǎng)基中，60d后觀察。表3結果表明，以添加2.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA激素濃度組合的分化效果最好，分化出的幼苗已有細根，且仍有分化趨勢，分化率可達80.5%。

綜合表3試驗結果可知，0.1mg/LNAA對原球莖增殖的效果較好，當濃度升高到0.5mg/L時，增殖效果會受到抑制；2.0mg/L6-BA最有利于原球莖分化，當濃度升高或降低時，原球莖分化效果均受到抑制。endprint

2.3試管苗生根培養(yǎng)

由表4可以看出，添加不同濃度NAA對鐵皮石斛試管苗生根影響較大：在不添加NAA的情況下，鐵皮石斛苗生根率僅為30.5%，平均根數(shù)2.6條，平均根長1.9cm，鐵皮石斛苗長勢一般；當NAA濃度為0.5mg/L時，生根效果最好，生根率為100%，平均根數(shù)6.6條，平均根長4.9cm，根系粗壯，根上伴有少許白色剛毛，苗長勢快?？偟慕Y果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要優(yōu)于0.1mg/L和1.0mg/LNAA這2個處理，可見適當濃度的NAA有利于鐵皮石斛苗的生根。

2.4煉苗移栽

鐵皮石斛屬附生蘭，根為氣生根，對生境要求比較苛刻，因此栽培基質及栽培容器的選擇對移栽成活與否至關重要。由表5可以看出，碎樹皮+無紡布袋組合的試管苗移栽成活率最高，為91.0%；其次為碎樹皮+塑料花盆組合，成活率為77.6%；而泥炭土+塑料花盆組合效果最差，成活率僅為8.9%，且實際觀察多有爛根現(xiàn)象。因此試驗中較為理想的組合為碎樹皮+無紡布袋，究其原因，是以碎樹皮為基質、無紡布袋作為栽培容器時，通氣且排水性良好，不會導致鐵皮石斛爛根，因此生長狀態(tài)最佳。

3討論

鐵皮石斛種子極為細小，蒴果內種子數(shù)以萬計，但其種子多為敗育，需與特定的真菌共生才能出芽，萌發(fā)率極低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是鐵皮石斛的最適培養(yǎng)溫度，最適合種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS基礎培養(yǎng)基；鐵皮石斛原球莖誘導和幼苗分化的最適激素組合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系數(shù)為8.7，分化率可達80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基對鐵皮石斛幼苗生根效果最好，根系發(fā)達，苗長勢快，生根率達100%；鐵皮石斛苗移栽宜用碎樹皮作為基質，更接近其原生境；為確保鐵皮石斛不爛根，以無紡布袋作為栽培容器，通氣排水好，鐵皮石斛苗生長健壯。鐵皮石斛離體快繁技術體系的建立可以有效緩解石斛市場供需矛盾，為鐵皮石斛種質資源保護與可持續(xù)利用提供了依據(jù)。

參考文獻：

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[12]林偉強，邊紅武，王君暉，等.鐵皮石斛類原球莖空氣干燥法超低溫保存中的脫水蛋白分析[J].園藝學報，2004，31（1）：64-68.endprint

2.3試管苗生根培養(yǎng)

由表4可以看出，添加不同濃度NAA對鐵皮石斛試管苗生根影響較大：在不添加NAA的情況下，鐵皮石斛苗生根率僅為30.5%，平均根數(shù)2.6條，平均根長1.9cm，鐵皮石斛苗長勢一般；當NAA濃度為0.5mg/L時，生根效果最好，生根率為100%，平均根數(shù)6.6條，平均根長4.9cm，根系粗壯，根上伴有少許白色剛毛，苗長勢快。總的結果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要優(yōu)于0.1mg/L和1.0mg/LNAA這2個處理，可見適當濃度的NAA有利于鐵皮石斛苗的生根。

2.4煉苗移栽

鐵皮石斛屬附生蘭，根為氣生根，對生境要求比較苛刻，因此栽培基質及栽培容器的選擇對移栽成活與否至關重要。由表5可以看出，碎樹皮+無紡布袋組合的試管苗移栽成活率最高，為91.0%；其次為碎樹皮+塑料花盆組合，成活率為77.6%；而泥炭土+塑料花盆組合效果最差，成活率僅為8.9%，且實際觀察多有爛根現(xiàn)象。因此試驗中較為理想的組合為碎樹皮+無紡布袋，究其原因，是以碎樹皮為基質、無紡布袋作為栽培容器時，通氣且排水性良好，不會導致鐵皮石斛爛根，因此生長狀態(tài)最佳。

3討論

鐵皮石斛種子極為細小，蒴果內種子數(shù)以萬計，但其種子多為敗育，需與特定的真菌共生才能出芽，萌發(fā)率極低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是鐵皮石斛的最適培養(yǎng)溫度，最適合種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS基礎培養(yǎng)基；鐵皮石斛原球莖誘導和幼苗分化的最適激素組合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系數(shù)為8.7，分化率可達80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基對鐵皮石斛幼苗生根效果最好，根系發(fā)達，苗長勢快，生根率達100%；鐵皮石斛苗移栽宜用碎樹皮作為基質，更接近其原生境；為確保鐵皮石斛不爛根，以無紡布袋作為栽培容器，通氣排水好，鐵皮石斛苗生長健壯。鐵皮石斛離體快繁技術體系的建立可以有效緩解石斛市場供需矛盾，為鐵皮石斛種質資源保護與可持續(xù)利用提供了依據(jù)。

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[12]林偉強，邊紅武，王君暉，等.鐵皮石斛類原球莖空氣干燥法超低溫保存中的脫水蛋白分析[J].園藝學報，2004，31（1）：64-68.endprint

2.3試管苗生根培養(yǎng)

由表4可以看出，添加不同濃度NAA對鐵皮石斛試管苗生根影響較大：在不添加NAA的情況下，鐵皮石斛苗生根率僅為30.5%，平均根數(shù)2.6條，平均根長1.9cm，鐵皮石斛苗長勢一般；當NAA濃度為0.5mg/L時，生根效果最好，生根率為100%，平均根數(shù)6.6條，平均根長4.9cm，根系粗壯，根上伴有少許白色剛毛，苗長勢快?？偟慕Y果表明：0.5mg/LNAA的生根效果要優(yōu)于0.1mg/L和1.0mg/LNAA這2個處理，可見適當濃度的NAA有利于鐵皮石斛苗的生根。

2.4煉苗移栽

鐵皮石斛屬附生蘭，根為氣生根，對生境要求比較苛刻，因此栽培基質及栽培容器的選擇對移栽成活與否至關重要。由表5可以看出，碎樹皮+無紡布袋組合的試管苗移栽成活率最高，為91.0%；其次為碎樹皮+塑料花盆組合，成活率為77.6%；而泥炭土+塑料花盆組合效果最差，成活率僅為8.9%，且實際觀察多有爛根現(xiàn)象。因此試驗中較為理想的組合為碎樹皮+無紡布袋，究其原因，是以碎樹皮為基質、無紡布袋作為栽培容器時，通氣且排水性良好，不會導致鐵皮石斛爛根，因此生長狀態(tài)最佳。

3討論

鐵皮石斛種子極為細小，蒴果內種子數(shù)以萬計，但其種子多為敗育，需與特定的真菌共生才能出芽，萌發(fā)率極低，一般低于5%[4]。研究表明：25℃是鐵皮石斛的最適培養(yǎng)溫度，最適合種子無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基為1/2MS基礎培養(yǎng)基；鐵皮石斛原球莖誘導和幼苗分化的最適激素組合是1/2MS+2mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，增殖系數(shù)為8.7，分化率可達80.5%；1/2MS+0.5mg/LNAA培養(yǎng)基對鐵皮石斛幼苗生根效果最好，根系發(fā)達，苗長勢快，生根率達100%；鐵皮石斛苗移栽宜用碎樹皮作為基質，更接近其原生境；為確保鐵皮石斛不爛根，以無紡布袋作為栽培容器，通氣排水好，鐵皮石斛苗生長健壯。鐵皮石斛離體快繁技術體系的建立可以有效緩解石斛市場供需矛盾，為鐵皮石斛種質資源保護與可持續(xù)利用提供了依據(jù)。

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[12]林偉強，邊紅武，王君暉，等.鐵皮石斛類原球莖空氣干燥法超低溫保存中的脫水蛋白分析[J].園藝學報，2004，31（1）：64-68.endprint