酸模屬5種植物的過氧化物酶（POD）同工酶的比較

翁貴英+孫愛群+楊友聯(lián)+王緒英+林長松

摘要：為了探明酸模屬（Rumex）植物種間親緣關(guān)系，采用聚丙烯酰胺垂直凝膠電泳技術(shù)，對酸模屬5種植物的過氧化物酶（POD）同工酶進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，酸模屬5種植物過氧化物酶（POD）同工酶共11條酶帶，不同種間酶譜存在較大差異；聚類分析表明，齒果酸模（Rumexdentatus）、尼泊爾酸模（R.nepalensis）、鈍葉酸模（R.obtusifolius）、皺葉酸模（R.crispus）這4種植物的親緣關(guān)系較近，戟葉酸模（R.hastatus）與這4種酸模的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且戟葉酸模是5種酸模中的較原始種。由結(jié)果可知，POD酶譜在一定程度上能反映種間的遺傳差異，有助于酸模屬物種的鑒定及親緣關(guān)系的探討。

關(guān)鍵詞：酸模屬；過氧化物酶；聚類分析；親緣關(guān)系

中圖分類號：Q554+.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0063-03

酸模屬（Rumex）是蓼科（Primulaceae）第2大屬，全世界約有150種，主產(chǎn)北溫帶，我國有26種2變種[1-2]，在全國各省區(qū)均有生產(chǎn)，其中貴州省有7種[3-4]。酸模屬可入藥的植物有16種，入藥部位為根，俗稱“土大黃”或“野甜菜”，主要含蒽醌類、黃酮類、萘衍生物、二苯乙烯類及鞣質(zhì)類等，具有清熱解毒、活血止血、通便殺蟲之功效，主治多種皮膚病、出血癥及各種炎癥[5]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，酸模屬植物有抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、防腐、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用[6]。目前國內(nèi)外學(xué)者對酸模屬的研究主要集中在化學(xué)成分與藥理活性[5-7]、形態(tài)解剖學(xué)[8-10]及染色體核型[11]等方面，未見關(guān)于其同工酶方面的研究報道。同工酶是指催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成有所不同的一組酶，廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)演化研究中[12]。過氧化物酶（POD）同工酶普遍存在于各種植物組織中，易于提取和分離，并且穩(wěn)定性較好，它在種質(zhì)資源的分類、系統(tǒng)發(fā)育、親緣關(guān)系[13]等方面的應(yīng)用較廣。筆者采用聚丙烯酰胺垂直凝膠電泳技術(shù)，對貴州省六盤水市酸模屬5種植物的過氧化物酶同工酶進(jìn)行了研究，探討其遺傳結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系及分類，旨在為酸膜屬植物的合理利用提供一定的參考資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料于2011年6月采自貴州省六盤水市水城縣境內(nèi)，基本情況詳見表1，由林長松教授（博士）鑒定。憑證標(biāo)本存放于六盤水師范學(xué)院生命科學(xué)系的植物標(biāo)本室。

1.2試驗方法

1.2.1酶液制備、電泳按實驗室的常規(guī)方法進(jìn)行[14-15]。

1.2.2染色取下凝膠，用蒸餾水洗2次，參照胡能書等的醋酸聯(lián)苯胺法[16]進(jìn)行染色。出現(xiàn)清晰酶帶后，棄染色液，用清水洗凈后拍照、測量并記錄，在7%乙酸中保存。

1.2.3分析方法統(tǒng)計酶帶數(shù)，計算其相對遷移率Rf值、酶譜相似度指數(shù)，相關(guān)公式為：

Rf值=酶帶遷移距離（cm）/溴酚藍(lán)遷移距離（cm）；

酶譜相似度指數(shù)=2個物種的相同酶帶數(shù)/（2個物種的相同酶帶數(shù)+2個物種的不同酶帶數(shù)）。

依據(jù)數(shù)量分類中二態(tài)特征的0/1編碼原則[17]，首先將各樣本看成一類，對每個個體的每條酶帶賦值，有酶帶的記為1，無酶帶的記為0，應(yīng)用DPSv3.01軟件，采用Jaccard系數(shù)，用類平均法（UPGMA）對酸模屬5種植物進(jìn)行聚類分析。

同工酶酶譜分析和命名參照熊全沫的方法[18-19]。以同工酶縮寫名稱的大寫字母代表酶蛋白，以1、2、3……表示向陽極遷移位點，愈靠近陽極的位點以愈小的數(shù)字表示，如POD-1、POD-2等。

2結(jié)果與分析

2.1過氧化物同工酶酶譜

由圖1可以看出，5種酸模屬植物共檢測出過氧化物酶（POD）酶譜帶11條，其中齒果酸模有7條帶（POD-2、POD-3、POD-4、POD-5、POD-6、POD-8、POD-10），其中POD-8、POD-10表達(dá)較強，POD-2、POD-3、POD-5、POD-6表達(dá)較弱；鈍葉酸模有5條帶（POD-1、POD-3、POD-4、POD-8、POD-10），其中POD-8、POD-10表達(dá)較強，POD-1、POD-3表達(dá)較弱；皺葉酸模有6條帶（POD-4、POD-5、POD-6、POD-8、POD-9、POD-11），其中POD-4、POD-5、POD-6、POD-8表達(dá)較弱；尼泊爾酸模有4條帶（POD-4、POD-7、POD-8、POD-10），其中POD-7、POD-8、POD-10表達(dá)較強，POD-4表達(dá)較弱；戟葉酸模只有1條帶（POD-7），表達(dá)較弱?？梢娝崮俨煌N植物酶譜帶的位置、數(shù)量及強弱存在著一定的差異。

根據(jù)酶譜位置可分為2個區(qū)：Ⅰ區(qū)（Rf=0.13～0.25）和Ⅱ區(qū)（Rf=0.48～0.66），其中Ⅰ區(qū)酶帶數(shù)為5條，Ⅱ區(qū)酶帶數(shù)為6條，可見2個區(qū)的酶帶數(shù)量、強弱不等。戟葉酸模只有1條弱帶，分布在Ⅰ區(qū)，其余酸模在Ⅰ區(qū)、Ⅱ區(qū)均有酶帶，且Ⅰ區(qū)酶帶表達(dá)強度高于Ⅱ區(qū)。齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模、尼泊爾酸模具有2條共同譜帶（POD-4、POD-8），Rf值分別為0.55、0.23，占總譜帶的18.18%，說明這4種酸模具有相似的遺傳基礎(chǔ)，保持著一定的遺傳一致性；在2～3個種間共有酶帶數(shù)為1～4條，如齒果酸模與鈍葉酸模有4條共同酶帶（POD-3、POD-4、POD-8、POD-10），Rf值分別為0.59、0.55、0.23、0.16，占總酶帶的36.36%；齒果酸模與皺葉酸模也有4條共同酶帶（POD-4、POD-5、POD-6、POD-8），Rf值分別為0.55、0.51、0.48、0.23，占總譜帶的36.36%；尼泊爾酸模、齒果酸模、鈍葉酸模有3條共同酶帶（POD-4、POD-8、POD-10），Rf值分別為0.55、0.23、0.16，占總酶帶的27.3%；皺葉酸模、鈍葉酸模、尼泊爾酸模有2條共同酶帶（POD-4、POD-8），Rf值分別為0.55、0.23，占總酶帶的18.18%；戟葉酸模和尼泊爾酸模有1條共同酶帶（POD-7），Rf值為0.25，占總酶帶的9.09%；此外，齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模各有1條特有酶帶?？傮w看來，齒果酸模、鈍葉酸模的酶帶大部分表達(dá)較強，尼泊爾酸模的酶帶表達(dá)也較強，戟葉酸模的酶帶表達(dá)較弱。5種酸模均有自己的酶譜特征，POD同工酶可以將5種酸模區(qū)分開，表明酶譜特征在一定程度上能反映物種間形態(tài)上的關(guān)系。

2.2相似度指數(shù)及聚類分析

Vaughan等提出以酶譜相似度指數(shù)預(yù)測種間親緣關(guān)系，相似度指數(shù)越大，說明物種間的酶譜差異越小，親緣關(guān)系越密切[20]。5種酸模屬植物POD酶譜的相似度指數(shù)見表2。

由表2可以看出，齒果酸模與鈍葉酸模、鈍葉酸模與尼泊爾酸模似度指數(shù)最大（0.500），其次是齒果酸模與皺葉酸模（0.444），戟葉酸模與齒果酸模、皺葉酸模、鈍葉酸模的相似度指數(shù)最?。?），表明齒果酸模與鈍葉酸模、皺葉酸模親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與齒果酸模、皺葉酸模、鈍葉酸模的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)相似度指數(shù)的大小，這5種植物兩兩之間的親緣關(guān)系由近到遠(yuǎn)排列依次為齒果酸模-鈍葉酸模/鈍葉酸模-尼泊爾酸模、齒果酸模-皺葉酸模、齒果酸模-尼泊爾酸模、皺葉酸模-尼泊爾酸模、尼泊爾酸模-戟葉酸模/鈍葉酸模-皺葉酸模、齒果酸模-戟葉酸模/鈍葉酸模-戟葉酸模/皺葉酸模-戟葉酸模。

采用Jaccard系數(shù)，用類平均法（UPGMA）對酸模屬5種植物進(jìn)行（0-1）聚類分析，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，酸模屬5種植物被分為2個類群，類群Ⅰ包括齒果酸模、尼泊爾酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模，類群Ⅱ為戟葉酸模。說明齒果酸模、尼泊爾酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模4種植物間的親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與這4種酸模間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3討論與結(jié)論

酸模屬不同種間POD同工酶酶譜存在較大差異，酶帶數(shù)目、位置及強弱不等，且有特有酶帶，表現(xiàn)出明顯的趨異性和遺傳差異性，表明酶譜特征可以作為酸模屬物種鑒定的依據(jù)，5種酸模屬植物之間分化較明顯，是分化較好的“物種”[21]。

根據(jù)Gracia等的觀點，同工酶酶帶數(shù)越多的種分化程度較高，是較進(jìn)化種，同工酶酶帶數(shù)越少的種分化程度較低，是較原始種[22]。酸模屬5種植物中，齒果酸模酶帶數(shù)最多（7條），戟葉酸模酶帶數(shù)最少（1條），說明齒果酸模為較進(jìn)化物種，戟葉酸模為較原始物種。鄭水慶等的ITS結(jié)果也說明戟葉酸模是較原始物種[23]，POD同工酶結(jié)果與ITS結(jié)果相吻合，說明POD同工酶可以用于酸模屬系統(tǒng)演化的研究。

相關(guān)數(shù)據(jù)和聚類分析顯示，齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模、尼泊爾酸模聚為1支，而戟葉酸模單獨聚為1支，說明齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模、尼泊爾酸模保持著一定的遺傳一致性，其親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與這4種酸模親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與鄭水慶等的ITS序列聚類結(jié)果相一致[23]。從外部形態(tài)上看，戟葉酸模為灌木，葉為戟形，其他4種酸模均為草本，葉為長橢圓形，戟葉酸模與其他4種酸模外部形態(tài)差異較大；形態(tài)分類上戟葉酸模屬于酸模亞屬，其他4種酸模屬于巴天酸模亞屬，說明同工酶聚類分析結(jié)果與形態(tài)特征相吻合，支持李安仁對酸膜亞屬及巴天酸膜亞屬的劃分[2]。

參考文獻(xiàn)：

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江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年第42卷第11期

藺經(jīng)，李曉剛，李慧，等.沙梨新品種蘇翠1號組培快繁體系研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：66-67.

2.2相似度指數(shù)及聚類分析

Vaughan等提出以酶譜相似度指數(shù)預(yù)測種間親緣關(guān)系，相似度指數(shù)越大，說明物種間的酶譜差異越小，親緣關(guān)系越密切[20]。5種酸模屬植物POD酶譜的相似度指數(shù)見表2。

由表2可以看出，齒果酸模與鈍葉酸模、鈍葉酸模與尼泊爾酸模似度指數(shù)最大（0.500），其次是齒果酸模與皺葉酸模（0.444），戟葉酸模與齒果酸模、皺葉酸模、鈍葉酸模的相似度指數(shù)最?。?），表明齒果酸模與鈍葉酸模、皺葉酸模親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與齒果酸模、皺葉酸模、鈍葉酸模的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)相似度指數(shù)的大小，這5種植物兩兩之間的親緣關(guān)系由近到遠(yuǎn)排列依次為齒果酸模-鈍葉酸模/鈍葉酸模-尼泊爾酸模、齒果酸模-皺葉酸模、齒果酸模-尼泊爾酸模、皺葉酸模-尼泊爾酸模、尼泊爾酸模-戟葉酸模/鈍葉酸模-皺葉酸模、齒果酸模-戟葉酸模/鈍葉酸模-戟葉酸模/皺葉酸模-戟葉酸模。

采用Jaccard系數(shù)，用類平均法（UPGMA）對酸模屬5種植物進(jìn)行（0-1）聚類分析，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，酸模屬5種植物被分為2個類群，類群Ⅰ包括齒果酸模、尼泊爾酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模，類群Ⅱ為戟葉酸模。說明齒果酸模、尼泊爾酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模4種植物間的親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與這4種酸模間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3討論與結(jié)論

酸模屬不同種間POD同工酶酶譜存在較大差異，酶帶數(shù)目、位置及強弱不等，且有特有酶帶，表現(xiàn)出明顯的趨異性和遺傳差異性，表明酶譜特征可以作為酸模屬物種鑒定的依據(jù)，5種酸模屬植物之間分化較明顯，是分化較好的“物種”[21]。

根據(jù)Gracia等的觀點，同工酶酶帶數(shù)越多的種分化程度較高，是較進(jìn)化種，同工酶酶帶數(shù)越少的種分化程度較低，是較原始種[22]。酸模屬5種植物中，齒果酸模酶帶數(shù)最多（7條），戟葉酸模酶帶數(shù)最少（1條），說明齒果酸模為較進(jìn)化物種，戟葉酸模為較原始物種。鄭水慶等的ITS結(jié)果也說明戟葉酸模是較原始物種[23]，POD同工酶結(jié)果與ITS結(jié)果相吻合，說明POD同工酶可以用于酸模屬系統(tǒng)演化的研究。

相關(guān)數(shù)據(jù)和聚類分析顯示，齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模、尼泊爾酸模聚為1支，而戟葉酸模單獨聚為1支，說明齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模、尼泊爾酸模保持著一定的遺傳一致性，其親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與這4種酸模親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與鄭水慶等的ITS序列聚類結(jié)果相一致[23]。從外部形態(tài)上看，戟葉酸模為灌木，葉為戟形，其他4種酸模均為草本，葉為長橢圓形，戟葉酸模與其他4種酸模外部形態(tài)差異較大；形態(tài)分類上戟葉酸模屬于酸模亞屬，其他4種酸模屬于巴天酸模亞屬，說明同工酶聚類分析結(jié)果與形態(tài)特征相吻合，支持李安仁對酸膜亞屬及巴天酸膜亞屬的劃分[2]。

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江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年第42卷第11期

藺經(jīng)，李曉剛，李慧，等.沙梨新品種蘇翠1號組培快繁體系研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：66-67.

2.2相似度指數(shù)及聚類分析

Vaughan等提出以酶譜相似度指數(shù)預(yù)測種間親緣關(guān)系，相似度指數(shù)越大，說明物種間的酶譜差異越小，親緣關(guān)系越密切[20]。5種酸模屬植物POD酶譜的相似度指數(shù)見表2。

由表2可以看出，齒果酸模與鈍葉酸模、鈍葉酸模與尼泊爾酸模似度指數(shù)最大（0.500），其次是齒果酸模與皺葉酸模（0.444），戟葉酸模與齒果酸模、皺葉酸模、鈍葉酸模的相似度指數(shù)最?。?），表明齒果酸模與鈍葉酸模、皺葉酸模親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與齒果酸模、皺葉酸模、鈍葉酸模的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。根據(jù)相似度指數(shù)的大小，這5種植物兩兩之間的親緣關(guān)系由近到遠(yuǎn)排列依次為齒果酸模-鈍葉酸模/鈍葉酸模-尼泊爾酸模、齒果酸模-皺葉酸模、齒果酸模-尼泊爾酸模、皺葉酸模-尼泊爾酸模、尼泊爾酸模-戟葉酸模/鈍葉酸模-皺葉酸模、齒果酸模-戟葉酸模/鈍葉酸模-戟葉酸模/皺葉酸模-戟葉酸模。

采用Jaccard系數(shù)，用類平均法（UPGMA）對酸模屬5種植物進(jìn)行（0-1）聚類分析，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，酸模屬5種植物被分為2個類群，類群Ⅰ包括齒果酸模、尼泊爾酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模，類群Ⅱ為戟葉酸模。說明齒果酸模、尼泊爾酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模4種植物間的親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與這4種酸模間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3討論與結(jié)論

酸模屬不同種間POD同工酶酶譜存在較大差異，酶帶數(shù)目、位置及強弱不等，且有特有酶帶，表現(xiàn)出明顯的趨異性和遺傳差異性，表明酶譜特征可以作為酸模屬物種鑒定的依據(jù)，5種酸模屬植物之間分化較明顯，是分化較好的“物種”[21]。

根據(jù)Gracia等的觀點，同工酶酶帶數(shù)越多的種分化程度較高，是較進(jìn)化種，同工酶酶帶數(shù)越少的種分化程度較低，是較原始種[22]。酸模屬5種植物中，齒果酸模酶帶數(shù)最多（7條），戟葉酸模酶帶數(shù)最少（1條），說明齒果酸模為較進(jìn)化物種，戟葉酸模為較原始物種。鄭水慶等的ITS結(jié)果也說明戟葉酸模是較原始物種[23]，POD同工酶結(jié)果與ITS結(jié)果相吻合，說明POD同工酶可以用于酸模屬系統(tǒng)演化的研究。

相關(guān)數(shù)據(jù)和聚類分析顯示，齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模、尼泊爾酸模聚為1支，而戟葉酸模單獨聚為1支，說明齒果酸模、鈍葉酸模、皺葉酸模、尼泊爾酸模保持著一定的遺傳一致性，其親緣關(guān)系較近，戟葉酸模與這4種酸模親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與鄭水慶等的ITS序列聚類結(jié)果相一致[23]。從外部形態(tài)上看，戟葉酸模為灌木，葉為戟形，其他4種酸模均為草本，葉為長橢圓形，戟葉酸模與其他4種酸模外部形態(tài)差異較大；形態(tài)分類上戟葉酸模屬于酸模亞屬，其他4種酸模屬于巴天酸模亞屬，說明同工酶聚類分析結(jié)果與形態(tài)特征相吻合，支持李安仁對酸膜亞屬及巴天酸膜亞屬的劃分[2]。

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