稀土在球蘭組織培養(yǎng)技術(shù)中的促根研究

唐 敏

成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院

球蘭（拉丁學(xué)名：Hoya carnosa（L.f.R.Br），又名：馬騮解、狗舌藤、鐵腳板等，屬捩花目蘿藦科球蘭屬植物。 攀援灌木，附生于樹上或石上，莖節(jié)上生氣根。 分布于云南、廣西、廣東、臺灣；熱帶及亞熱帶其他地區(qū)也有栽培或野生。球蘭開花時綻放一簇簇傘形的腋生聚傘花序,常常由12～30 朵星狀小花聚集成球形,故名球蘭［1］隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，球蘭通過組培技術(shù)進(jìn)行商業(yè)化批量培育生產(chǎn)已是趨勢。傳統(tǒng)的球蘭的培育幾乎都是通過扦插繁殖法， 但此繁殖法生根慢，成活移植后，發(fā)苗勢不旺，生長也比較緩慢。因此，通過組織培養(yǎng)技術(shù)來繁殖球蘭，是解決以上繁殖問題的重要技術(shù)手段。 目前，球蘭的組織培養(yǎng)技術(shù)在實驗室階段性實驗已有報道，有了建立起無菌系并能擴(kuò)繁的先例， 然而此技術(shù)日前還只停留在實驗室可行階段，只是提供了應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)的手段，而非是良好運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)的方法。 隨著市場的需要，組織培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用在球蘭的培育上，主要是期望能進(jìn)行批量生產(chǎn)并提高瓶苗的移栽成活率，這也是目前亟待解決的重點問題。 而要提高瓶苗的質(zhì)量和移栽成活率，在球蘭組織培養(yǎng)的過程中，組織培養(yǎng)的生根培養(yǎng)基配方是關(guān)鍵。本實驗在球蘭的生根基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中添加了稀土元素，在實驗結(jié)果中得到了明顯的效果。

一、材料與方法

1.外植體選取

從市場上買入較好的球蘭品種， 選擇長勢較好，無病蟲害的若干成熟葉片作為外植體。 氯化鑭Lacl3和硝酸鑭La(NO3)3為國產(chǎn)分析純。

2.外植體消毒滅菌

將外植體的葉片用洗衣粉溶液洗滌，然后用清水沖洗20 分鐘；在超凈工作臺上，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液浸泡15 秒，無菌水沖洗2 次，再置于0.1%升汞溶液中浸泡10 分鐘，最后用無菌水沖洗4～5 次，濾干水分；用解剖刀將經(jīng)表面滅菌的葉片切成0.5 平方厘米的小塊，待接種。

3.培養(yǎng)基制備

（1）基本培養(yǎng)基的制備。 根據(jù)MS 和White 母液成分及用量稱取藥品，使其充分溶解，并按相應(yīng)濃度分別依次取用，先量取大量元素母液，再依次加入微量元素母液、鐵鹽母液和有機(jī)成分。

（2）按外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖繼代培養(yǎng)基、芽分化培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基來加入激素， 其分別添加為：外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+KT 0.5 毫克·升-1+6-BA 0.5 毫克·升-1+NAA 0.5 毫克·升-1；增殖繼代培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.5 毫克·升-1+NAA 0.2 毫克·升-1；芽分化培養(yǎng)基： MS+ KT 0.5 毫克·升-1+ NAA 0.5 毫克·升-1+ GA 1.0 毫克·升-1； 生根培養(yǎng)基：White+GA 0.5毫克·升-1+Lacl3或者是La(NO3)3，其分別設(shè)置添加有8 個不同濃度氯化鑭和硝酸鑭， 即： 氯化鑭（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、5、10 毫克·升-1）+硝酸鑭（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、5、10 毫克·升-1）。

（3）溶化瓊脂。稱取瓊脂7 克·升-1，用蒸餾水加熱燒開熔化瓊脂，待瓊脂完全熔化后，把調(diào)配好的激素和稀土元素溶液加入，用pH 試紙測pH 值，并用0.1摩爾·升-1的NaOH 或Hcl 調(diào)節(jié)pH 值為5.8， 最后加水定容至所需體積。

（4）分裝。將配好的培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)瓶中，分裝時注意不要把培養(yǎng)基倒在瓶口上， 以防引起污染，然后用封口膜或瓶蓋封口，裝入高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行滅菌。

4.組織培養(yǎng)

將外植體在超凈工作臺上接種于外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 天后，將形成的愈傷組織用解剖刀進(jìn)行分切， 分別轉(zhuǎn)接于增殖繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；愈傷組織進(jìn)行增殖繼代培養(yǎng)后，再將其轉(zhuǎn)接于芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽和芽點的促生培養(yǎng)； 當(dāng)芽生長至2～3 厘米高的壯苗時，從瓶中取出，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。 以0 毫克·升-1作對照，生根苗每處理10 瓶，每瓶接種5 株無菌幼苗，于光照強(qiáng)度1500～2000 勒克斯，光照時間12 小時·天-1，溫度（25±2）℃的條件下培養(yǎng)，60 天后觀察實驗結(jié)果并對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

5.移栽

將生根后的球蘭組培苗進(jìn)行煉苗后移栽。

6.數(shù)據(jù)測定與方法

接種60 天后統(tǒng)計球蘭生根數(shù)、生根率（生根率=生根的叢生數(shù)／接種的叢生數(shù)×100%）、根長（游標(biāo)卡尺測定） 以及存活率 （存活叢生數(shù)／接種叢生數(shù)×100%）。 每個指標(biāo)重復(fù)3 次測定。

7.試驗數(shù)據(jù)采用spass16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

二、結(jié)果分析

1.氯化鑭對球蘭組培苗的生根及抗性影響

表1 氯化鑭對球蘭組培苗生根率及移栽成活率影響

從表1 看出，當(dāng)Lacl3的濃度為0.2 毫克·升-1時，球蘭的根長、生根數(shù)、生根率及存活率都是最佳，分別數(shù)值為：2.86、2.83、100 及100。由此得出，適當(dāng)?shù)奶砑覮acl3，對球蘭的生長是有利的，但當(dāng)超過一定量值時，隨著濃度的增加，其效果越不理想。 Lacl3添加的最佳濃度為0.2 毫克·升-1.。

2.硝酸鑭對球蘭組培苗的生根及抗性影響

表2 硝酸鑭對對球蘭組培苗生根率及移栽成活率影響

從表2 得出結(jié)論， 當(dāng)La (NO3)3的濃度為0.6 毫克·升-1時，球蘭的根長生長指數(shù)最佳，為3.53，而當(dāng)La(NO3)3的濃度為0.4 毫克·升-1時，生根數(shù)為最佳值3.66。當(dāng)La(NO3)3的濃度為0.2～0.6 毫克·升-1時，生根率及存活率都是最佳，數(shù)值均為100。由此得出，當(dāng)La(NO3)3的濃度為0.2～0.6 毫克·升-時，對球蘭的生長是有利的，但當(dāng)超過0.6 毫克·升-時，隨著濃度的增加，其效果越不理想。La(NO3)3添加的最佳濃度為0.4～0.6毫克·升-1。 在促進(jìn)球蘭的根長生長時，La(NO3)3的濃度以0.6 毫克·升-為最佳， 而較低的濃度則有利于根系的數(shù)量增長， 當(dāng)La (NO3)3的濃度為0.4 毫克·升-1時，其生根數(shù)較多。

三、討論

大量研究表明，稀土元素具有一定的生理調(diào)控特性，對植物生長發(fā)育和品質(zhì)改善具有促進(jìn)作用，但根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料看出，不同材料所用稀土種類、濃度和不盡相同，因此確定特定植物、組織、器官的最佳稀土種類、濃度需要不斷摸索［2,3］。

從以上表中看出， 稀土濃度較低濃度時， 即在0.2～0.6 毫克·升-1時對球蘭根系的生長有一定促進(jìn)作用，但隨著濃度的不斷升高，反而起到了抑制作用，與段曉宇等［4］在稀土對細(xì)莖石斛組培苗影響的研究結(jié)果有一致性。 據(jù)文獻(xiàn)，稀土元素具有一定的生理活性，影響植物的外部形態(tài)和生長發(fā)育，對植物有較好的抗逆效應(yīng)［5］，可促進(jìn)植物根系生長發(fā)育，影響酶活性［6］。在本實驗中，稀土對根的促進(jìn)作用很明顯。在表1 中，稀土Lacl3對球蘭的促根作用峰值為濃度達(dá)0.2 毫克·升-1，其根長和數(shù)量都達(dá)最佳。 在表2 中，稀土La(NO3)3對球蘭的促根作用峰值為濃度達(dá)0.6 毫克·升-1時，其根長是最佳值，在一定范圍內(nèi)，較高濃度有利于根的伸長生長；促根數(shù)量最佳濃度峰值為0.4 毫克·升-1。周青等［7］在對La 在大豆幼苗作用的研究中得出，其機(jī)制在于La 能促進(jìn)植物光合作用,增加葉綠素含量,提高硝酸還原酶和脫氫酶活性,促進(jìn)根系生長。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，氯化鑭和硝酸鑭對球蘭根系的作用在濃度上有所區(qū)別。 氯化鑭在濃度為0.2 毫克·升-1時， 球蘭的根在長度和數(shù)量上都達(dá)到了顯著；而硝酸鑭的濃度則相對高一些， 在達(dá)到0.4～0.6 毫克·升-1時，其促根作用才得到顯著表現(xiàn)。

本研究中，稀土對球蘭組培苗的生根率和存活率（抗逆性）有一定影響，在一定濃度范圍內(nèi)有所良好表現(xiàn)，但差異不顯著，但是超出了一定濃度，氯化鑭在超過0.6 毫克·升-1和硝酸鑭超過0.8 毫克·升-1時，表現(xiàn)出抑制作用。 據(jù)文獻(xiàn)報道，使用稀土,可增強(qiáng)作物對不良環(huán)境條件的抵抗能力， 但高濃度稀土則效果不明顯,甚至產(chǎn)生藥害。 對于稀土元素能增強(qiáng)作物的抗逆性， 寧加賁認(rèn)為在于稀土離子能與細(xì)胞膜的磷脂結(jié)合,調(diào)節(jié)鈣的代謝,并取代Ca2+離子,參與與Ca2+有關(guān)的許多生理過程。 所以,稀土離子能維持細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性,提高細(xì)胞膜的保護(hù)功能,增強(qiáng)作物對不良環(huán)境的抵抗能力。

［1］高尚士.藤本奇花-球蘭[J].國土綠化,2005,3:43.

［2］汪燕鳴，王飛，王躍.稀土元素農(nóng)業(yè)應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.化工時刊，2007，21（2）：47-49.

［3］李永裕，潘騰飛，邱棟梁.稀土元素對植物生物學(xué)作用機(jī)制的研究進(jìn)展 ［J］. 中國農(nóng)學(xué)通報，2005，21（12）：217-221.

[4]段曉宇，汪維雙，楊紅等.硝酸鑭、硝酸鈰對細(xì)莖石斛組培苗生長的影響[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，30（2）：2-3.

［5］阮志平，王芬芬，黃全能等.硝酸鑭處理對短穗魚尾葵幼苗耐寒性的影響 ［J］. 熱帶作物學(xué)報，2011，32（6）：1055-1059.

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[7]周 青,黃曉華,曹玉華等. La 對Pb,Cd 復(fù)合污染大豆幼苗的緩解作用[J].中國稀土學(xué)報,1998,16(4):366.