血液中氨基酸含量的高效液相色譜及其質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定方法研究進(jìn)展

王清華，熊筱娟，張 鳳，高守紅

(1. 宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000;2. 第二軍醫(yī)大學(xué) 長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003)

氨基酸是機(jī)體代謝的重要物質(zhì)之一，具有廣泛的生物學(xué)功能，是構(gòu)成生物機(jī)體蛋白質(zhì)分子的基本組成單位和維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。人體內(nèi)參與氨基酸代謝的相關(guān)蛋白和酶發(fā)生缺陷或者各種病理狀態(tài)都會(huì)導(dǎo)致氨基酸代謝異常和血液氨基酸水平的改變。例如，對(duì)稱二甲基精氨酸(SDMA)和非對(duì)稱甲基精氨酸(ADMA)的變化能夠較好地反映在腎臟疾病中腎功能受損傷的嚴(yán)重程度。［1－5］因此，監(jiān)測(cè)生物樣本中(血液、尿液等)的氨基酸含量具有重要的意義，［6－10］在臨床上觀測(cè)氨基酸的動(dòng)態(tài)變化行為可以為相關(guān)疾病的診斷提供輔助依據(jù)。

目前，有關(guān)氨基酸分析方法研究的報(bào)道比較多，常用的有氨基酸分析儀測(cè)定法(amino acid analyzer，AAA)、高效液相色譜法(High－performance liquid chromatography，HPLC)，氣相色譜法(gas chromatography，GC)，毛細(xì)管電泳法(Capillary electrophoresis，CE)等。近30 年來(lái)，隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的出現(xiàn)與普及，作為一新興的技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用到了生命科學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域。因此，作為高特異性和高靈敏度檢測(cè)工具的質(zhì)譜，同樣在分析生物樣本中小分子氨基酸含量發(fā)揮著重要的作用。［11－13］本文主要對(duì)HPLC，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC－MS/MS 和UPLC－MS/MS)等技術(shù)在氨基酸定量分析中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述和評(píng)價(jià)。

1 液相色譜法

由于氨基酸的極性比較大，在普通的C18 反相色譜柱上保留行為極差，因此，在復(fù)雜的生物樣本或非生物基質(zhì)中，廣泛地定量氨基酸是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)。在過(guò)去的60 年里，研究者為了使生物樣本中的氨基酸能夠達(dá)到有效地分離與檢測(cè)，常用的分析方法是離子交換色譜分析結(jié)合茚三酮柱后衍生化法，此法首先將氨基酸分離，再進(jìn)行衍生化處理并進(jìn)行紫外檢測(cè)。此方法樣品用量大且缺乏特異性，［14］氨基酸衍生化后，必須在紫外條件下檢測(cè)，靈敏度低，不適合某些微量氨基酸定量，且成本代價(jià)高;柱前衍生化HPLC 法，采用不同的衍生化試劑，例如丹磺酰氯(Dansyl－Cl)、異硫氰酸苯酯(PITC)、鄰苯二甲醛(OPA)、6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)等，樣本處理步驟復(fù)雜，干擾因素較多，分析時(shí)間長(zhǎng)且耗費(fèi)高，且無(wú)法達(dá)到臨床上高靈敏、高通量、高特異性的分析要求。在臨床血液樣本中，化合物數(shù)量多且復(fù)雜，一些化合物跟氨基酸結(jié)構(gòu)相似或分子量相同，則有可能保留時(shí)間相同，有可能分析物無(wú)法分離，造成成分的不確定因素，此外，血液是體內(nèi)樣本，分析物往往需要內(nèi)標(biāo)物校正，而內(nèi)標(biāo)物最好的選擇是相應(yīng)同位素的化合物，但是柱前衍生化法不適合分析同位素樣品。

2 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法

傳統(tǒng)分析氨基酸采用柱前衍生化和柱后衍生化分析方法，使其生成具有紫外或熒光基團(tuán)的衍生化合物后進(jìn)行檢測(cè)。但是方法操作復(fù)雜繁瑣、內(nèi)外影響因素較多、耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，費(fèi)用較高，給臨床血液樣本檢測(cè)帶來(lái)了極大的不便，技術(shù)難以推廣應(yīng)用。

新興的各種串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，廣泛地運(yùn)用到各種大分子和小分子化合物的檢測(cè)，從傳統(tǒng)的方法中脫穎而出，并應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如臨床診斷治療、藥物分析等各個(gè)分支學(xué)科。在HPLC－MS/MS分析中，研究者們同樣采用衍生化法分析氨基酸，雖然缺乏特異性，但極大地縮短了分析時(shí)間，而且靈敏性高。Yohei 等［15］通過(guò)HPLC－MS/MS 方法和衍生化技術(shù)在20 min 內(nèi)完成了21 種氨基酸的定量，LOD達(dá)到了5.1fmol。Shimbo 等［16］采用APDS(3－aminopyridyl－N－h(huán)ydroxysuccinimidyl carbamate)柱前衍生化22 種哺乳動(dòng)物血漿氨基酸后，通過(guò)HPLC/ESI－MS/MS 在10 min 之內(nèi)完成分析定量。無(wú)論是從分離性能上，還是從分析時(shí)間和靈敏度上比較，HPLC－MS/MS 都要比傳統(tǒng)的HPLC、氨基酸分析儀等都要優(yōu)越。

由于衍生化技術(shù)的操作復(fù)雜、耗時(shí)性以及缺乏特異性，無(wú)法適用于臨床血樣樣本的高通量分析。近年來(lái)研究者們通過(guò)不斷的研究與探索，采用揮發(fā)性離子對(duì)試劑，如七氟丁酸(Heptafluorobutyric Acid，HFBA)、九氟戊酸(Nonafluorovaleric Acid，NFVA)、全氟庚酸(Tridecafluoroheptanoic acid，TDFHA)等，不需要對(duì)氨基酸進(jìn)行衍生化就可以對(duì)其進(jìn)行直接分析，簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法逐漸開始在復(fù)雜生物基質(zhì)中氨基酸分析發(fā)揮主導(dǎo)地位。Zoppa 等［17］研究一種HPLC－ESI－MS/MS 定量或定性分析新生兒干燥血點(diǎn)的氨基酸，不需要衍生化試劑，直接在流動(dòng)性中添加TDFHA，在10min 之內(nèi)就分析完40 種氨基酸以及同分異構(gòu)體。Le 等［12］在流動(dòng)相水相系統(tǒng)添加1mmol/L TDFHA，開發(fā)了一種快捷而靈敏的UPLC－MS/MS 定量法，分析33 種血漿氨基酸只運(yùn)行了10min，并且與氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)比擬合分析，線性擬合度達(dá)到R2＞0.96 以上，可以完全替代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀。與傳統(tǒng)的方法相比，結(jié)合離子對(duì)試劑分析氨基酸，LC－MS/MS 技術(shù)具有高特異性，高靈敏性和高通量分析的優(yōu)勢(shì)(見表1)，為臨床分析生物標(biāo)志物的探索、解說(shuō)疾病的機(jī)理等提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。

表1 氨基酸檢測(cè)方法對(duì)比Table 1 Comparison of detective methods of amino acids analysis

3 血液中氨基酸檢測(cè)的臨床應(yīng)用

現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，疾病在本質(zhì)上是一個(gè)從基因失調(diào)開始，經(jīng)表達(dá)異常、代謝異常、功能失調(diào)、機(jī)構(gòu)改變直至產(chǎn)生臨床表現(xiàn)的生化改變過(guò)程。一旦出現(xiàn)臨床癥狀、體征或形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，疾病實(shí)際上已處于發(fā)生發(fā)展的終末階段。代謝是機(jī)體最為重要的一環(huán)，特征代謝物的出現(xiàn)或者改變一般要遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于傳統(tǒng)的病理學(xué)終點(diǎn)。在生化分子發(fā)生變化的階段，并未檢測(cè)到任何組織病理學(xué)的改變前，此時(shí)對(duì)疾病進(jìn)程的干預(yù)使得疾病的治愈有極大的可能性。血液氨基酸在體內(nèi)維持著一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡體系，是機(jī)體代謝重要的一環(huán)，很多代謝疾病，如腫瘤、糖尿病、肝病、前列腺癌、腎毒性等都會(huì)導(dǎo)致氨基酸代謝紊亂。Yuan 等［18］運(yùn)用HPLC 測(cè)定帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)的血液神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸時(shí)發(fā)現(xiàn)，在疾病的早期門冬氨酸、谷氨酸、牛磺酸、絲氨酸和谷氨酸與γ－氨基丁酸的比值呈顯著下降的趨勢(shì)，有助于早期預(yù)測(cè)帕金森病。Nagata等［19］通過(guò)液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜分析日本婦女絕經(jīng)前的血漿氨基酸圖譜，提出精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、門冬氨酸的紊亂能夠評(píng)估乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)率。Magnusson［20］等采用HPLC－MS/MS 連續(xù)12 年監(jiān)測(cè)心血管患者血液中氨基酸，發(fā)現(xiàn)異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的含量變化在預(yù)測(cè)糖尿病的同時(shí)也可以預(yù)測(cè)心血管疾病。

4 結(jié)語(yǔ)

血液中的氨基酸是代謝組學(xué)中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，因此監(jiān)測(cè)其含量可以輔助臨床診斷或提供重要的疾病分析依據(jù)。目前為止，檢測(cè)氨基酸的方法眾多且都具有各自的特點(diǎn)，選擇適合的檢測(cè)方法一直倍受到醫(yī)學(xué)界的重視。新興的高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有快捷、準(zhǔn)確、高靈敏性、高特異性及高通量的優(yōu)勢(shì)，將成為臨床分析氨基酸以及其它代謝疾病分子的主流。

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