蕓薹屬油菜種間與亞種間雜交親和性研究

陳紀(jì)鵬，熊桃園

(宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春，336000)

油菜屬于十字花科蕓薹屬，它是我國(guó)重要的油料作物，有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其栽培品種包括3種:白菜型油菜(Brassica rapa AA，2n=20)、芥菜型油菜(B. juncea AABB，2n =36)、甘藍(lán)型油菜(B. napus AACC，2n =38)。白菜型油菜在我國(guó)分布范圍廣，具有分枝多且分枝部位低、抗寒、耐瘠、生育期短等特征。芥菜型油菜的優(yōu)良性狀很多，其中有大多優(yōu)點(diǎn)是甘藍(lán)型油菜所不具備的，例如:黃籽、抗病蟲(chóng)、抗倒伏、抗裂角、耐旱、耐瘠薄、含油量高等。［1］白菜型油菜的不同品種間性狀具有一定的差異，但是同屬白菜型油菜的不同品種和亞種間親緣關(guān)系較近;而芥型油菜與甘藍(lán)型油菜之間屬于不同種之間的雜交。白菜型油菜與蕓薹屬其它種間的雜交可以創(chuàng)造出多種多樣的雜種后代，形成豐富的種質(zhì)資源。雜交親和性是研究較多的一個(gè)方面，例如白菜型油菜與芥菜型油菜雜交的親和指數(shù)為0.037 和0.113，正反交親和性相差很大，以芥菜型油菜為母本時(shí)親和性較好。［2］白菜型油菜與菜型油菜油菜間的雜交也用于拓展白菜型油菜的遺傳資源，雜種一代通過(guò)與白菜型油菜較續(xù)回交創(chuàng)造滲入系成功將菜型油菜的一些性引入白菜型油菜。［3］白菜型油菜常與甘藍(lán)雜交用于合成新型油菜甘藍(lán)型油菜。［4，5］白菜型油菜具有多個(gè)亞種和變種，它們之間雜交可以產(chǎn)生性狀優(yōu)良的雜種后代。不同白菜型油菜品種和自交系間的雜交有些組合表現(xiàn)為超親優(yōu)勢(shì)，但有組合去表現(xiàn)為負(fù)超親優(yōu)勢(shì)。［1］因此，研究油菜種內(nèi)和種間雜交對(duì)利用豐富的白菜型油菜資源意義重大。本研究進(jìn)行了矮壯青和黃秧白，芥菜型油菜與甘藍(lán)型油菜之間雜交，研究種間和亞種間雜交的親和性以及雜種后代的遺傳特征，分析二者之間存在的差異。并且分析各個(gè)組合雜種后代的雜種優(yōu)勢(shì)、優(yōu)良性狀，創(chuàng)造有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新種質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料

選用兩個(gè)白菜型油菜亞種‘矮壯青’和‘黃秧白’進(jìn)行亞種間雜交，芥菜型油菜‘雪里蕻’和甘藍(lán)型油菜品種‘中油821’進(jìn)行種間雜交。于10 月上旬在宜春學(xué)院實(shí)驗(yàn)田播種，為了使父母本花期相遇，甘藍(lán)型油菜適當(dāng)晚播。當(dāng)?shù)赜筒松L(zhǎng)季節(jié)氣候溫暖濕潤(rùn)，適合油菜生長(zhǎng)。

1.2 方法

1.2.1 雜交方法 矮壯青和黃秧白之間的正反交組合以及以芥菜型油菜為母本甘藍(lán)型油菜為父本的雜交，對(duì)母本進(jìn)行人工剝蕾，嚴(yán)格去雄后套袋隔離，并掛牌注明去雄時(shí)間、雜交組合名稱(chēng)。于第二天早晨再進(jìn)行人工授粉，最后套袋處理以防止串粉，7d 后去掉紙袋。授粉后15d 后，取膨大的角果進(jìn)行胚培養(yǎng)。成熟時(shí)按組合分別收獲種子。

1.2.2 雜交親和性觀察 將芥菜型油菜嚴(yán)格去雄后套袋，第二天早晨收集新鮮的甘藍(lán)型油菜的花粉，將其輕輕涂抹于去雄后的母本雌蕊柱頭，最后套袋。分別于4、8、12、16h 后各摘取5 枚母本雌蕊，用卡諾液固定1h，保存在70%酒精中。接著于8mol/L NaOH 溶液中浸泡12h，再用蒸餾水反復(fù)沖洗，然后在0.1%苯胺藍(lán)溶液中染色24h。最后將染色的雌蕊放于載玻片壓片，放于顯微鏡下觀察花粉管的萌發(fā)及伸長(zhǎng)情況并用裝有CCD 的熒光顯微鏡拍照。

1.2.3 胚培養(yǎng) 在芥菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交中，人工授粉后15－20d，摘取膨起的角果于燒杯內(nèi)，用75%濃度的酒精和0.1%濃度的升汞溶液先后進(jìn)行2min、15min 的浸泡消毒，消毒后取出角果，再用無(wú)菌水漂洗3 次。對(duì)所需的實(shí)驗(yàn)操作物品進(jìn)行消毒，最后在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)上，用鑷子剝?nèi)〕鼋枪麅?nèi)部幼胚移置于MS 培養(yǎng)基的表面上，操作完畢后將置于27℃、12h 光照12h 黑暗的光周期條件下的培養(yǎng)箱里面進(jìn)行培養(yǎng)。幼胚出芽時(shí)，將芽轉(zhuǎn)移到MS+0.25mg/L NAA+1.5mg/L 6－BA 的培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)。

1.2.4 雜種后代性狀觀察 將矮壯青和黃秧白正反交，芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜雜交得到的雜種在符合油菜播種氣候的時(shí)期種在土壤中，精心栽培并觀察記錄其各階段的生長(zhǎng)狀況以及形態(tài)性狀。

1.2.5 花粉育性觀察 在油菜開(kāi)放旺盛的時(shí)候，采摘雜種5 枚花朵。在載玻片上滴加1 ～2 滴醋酸洋紅染色劑，用鑷子鑷取飽滿的花藥置于載玻片染色劑所在位置上，并用鑷子壓迫花藥擠出花粉粒并除去花藥壁。然后蓋上蓋玻片置于顯微鏡下觀察，凡呈飽滿、圓形、大、被染色程度深的花粉是可育的，反之為不可育的。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚培養(yǎng)情況

以芥菜型油菜為母本，甘藍(lán)型油菜為父本進(jìn)行人工雜交，在角果內(nèi)生長(zhǎng)出幼胚后進(jìn)行該雜種的胚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將幼胚共25 個(gè)接種于MS 培養(yǎng)基，不加任何激素，蔗糖濃度3%。培養(yǎng)5d 左右，幼胚根開(kāi)始伸長(zhǎng)，并產(chǎn)生大量白色根毛。繼續(xù)培養(yǎng)，只有18 個(gè)胚即72%的胚產(chǎn)生芽并長(zhǎng)成幼苗。在培育幼胚生長(zhǎng)成幼株的一段時(shí)間后移栽至土壤中，全部幼苗都能成活。

2.2 雜種后代形態(tài)特征觀察

將黃秧白和矮壯青正反交和以芥菜型油菜為母本甘藍(lán)型油菜為父本的雜交雜種種植于土壤后觀察各個(gè)雜交組合雜種后代的形態(tài)特征(圖1A、B、C)。矮壯青和黃秧白正反交雜種性狀相似，很難從外形上辨別兩者。兩雜種的植株高度都處于兩親本之間，但是一級(jí)分枝數(shù)量超過(guò)了親本，并且結(jié)實(shí)率也超過(guò)了親本。分枝高度較低，表現(xiàn)為叢生。處于苗期階段的正反交雜種對(duì)比，矮黃雜種性狀更接近矮壯青，植株矮小，葉片顏色淡綠。而黃矮組合雜種其性狀更接近黃秧白，植株稍高，葉片黃綠，前者葉片較后者大，抽薹后兩雜種性狀才變得相似幾乎一樣，表現(xiàn)在葉片大小、葉色、花期等方面。成熟期植株遺傳性狀如表1 表示，生長(zhǎng)旺盛，分枝較多，角果數(shù)多，且結(jié)實(shí)正常。

圖1 雜種形態(tài)學(xué)、花粉、花粉萌發(fā)情況

A:黃秧白;B:矮壯青×黃秧白;C:矮壯青;D:芥菜型油菜×甘藍(lán)型油菜雜種;(標(biāo)尺=10cm)E:芥菜型油菜×甘藍(lán)型油菜雜種花(左:芥菜型油菜，中:雜種，右:甘藍(lán)型油菜);F:芥菜型油菜×甘藍(lán)型油菜雜種花的雌蕊和雄蕊;(標(biāo)尺=1cm)G:矮壯青×黃秧白雜種花粉;H:芥菜型油菜×甘藍(lán)型油菜雜種花粉;(標(biāo)尺=50u)I:芥菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交花粉萌發(fā)。(標(biāo)尺=1mm)

表1 雜種形態(tài)學(xué)特征

芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜雜種種子顏色接近芥菜型油菜即紅褐色，苗期階段其性狀更接近芥菜型油菜(圖1D)，抽薹后植株高大超過(guò)親本植株高度，枝條粗壯，一級(jí)分枝數(shù)目超過(guò)親本，但是第一分枝高度低于親。植株形態(tài)類(lèi)似芥菜型油菜，植株高大(表1)。雜種葉片顏色接近甘藍(lán)型油菜，葉型也與甘藍(lán)型油菜相似，表面有蠟粉，葉片顏色深綠?；ǖ男螒B(tài)介于雙親之間，大小接近芥菜型油菜(圖1E)。雌蕊發(fā)育較好，但雄蕊發(fā)育較差，花藥不能伸至柱頭頂部(圖1F)。大多數(shù)角果內(nèi)僅有2－3 粒種子，而且多數(shù)種子不飽滿。大量角果未形成種子，角果發(fā)育不良(表1)。

2.3 雜種花粉育性與自交結(jié)實(shí)率

根據(jù)各品種雜種結(jié)實(shí)數(shù)據(jù)可知，矮壯青和黃秧白正反交雜種其所結(jié)角果數(shù)目較多，幾乎都是飽滿的種子，而芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜所結(jié)角果數(shù)目較少，不飽滿的占大多數(shù)。另外通過(guò)花粉粒染色試驗(yàn)可知，黃秧白和矮壯青雜種的花粉育性為95%左右，反交組合的花粉育性也為95% 左右 (圖1G)。芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜雜種的花粉育性僅為33%左右(圖1H)。

2.4 雜交親和性的觀察

以芥菜型油菜為母本，甘藍(lán)型油菜為父本人工授粉后的4h，母本柱狀上附著大量花粉，有35%以上的花粉出現(xiàn)萌發(fā)(圖1I)。16h 后，花粉萌發(fā)率為95%左右，花粉管伸長(zhǎng)并且能夠伸長(zhǎng)至胚珠。說(shuō)明大部分父本花粉可以克服種間雜交的殖隔離完成雌雄配子的融合過(guò)程。授粉后7d 左右，角果部分籽粒開(kāi)始膨大。成熟期平均每個(gè)角果可形成3－5粒飽滿種子，同時(shí)還有大量的不飽滿種子形成。飽滿種子種植后部分能正常發(fā)芽，發(fā)芽率為50.5%。所得全部植株經(jīng)鑒定全部為真雜種(表2)。

表2 雜交親和性觀察

3 結(jié)論與討論

影響遠(yuǎn)緣雜交親和性大小的因素有很多，其中環(huán)境因素是影響油菜遠(yuǎn)緣雜交親和性大小的因素之一，［6］高溫、長(zhǎng)日照等環(huán)境條件能夠促進(jìn)受精作用，因此通常選在陽(yáng)光充足溫度高的時(shí)間段對(duì)母本進(jìn)行人工去雄授粉。除此之外，很多實(shí)驗(yàn)研究證明，遠(yuǎn)緣雜交其后代得到的難易程度與親本的親緣關(guān)系密切相關(guān)，關(guān)系越近越容易得到后代，反之則越困難。［7］本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了白菜型油菜種內(nèi)雜交實(shí)驗(yàn)，即矮壯青和黃秧白之間的正反交，它們相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)所做的油菜種間雜交實(shí)驗(yàn)，即芥菜型油菜和芥菜型油菜雜交組合，更容易得到雜種。以蔊菜為母本、甘藍(lán)型油菜為父本進(jìn)行雜交，直接人工去雄授粉出現(xiàn)兩個(gè)花序開(kāi)花結(jié)實(shí)，相反以甘藍(lán)型油菜為母本、蔊菜為父本的雜交組合，授粉后的子房?jī)H僅是膨大而已，并且在其生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)停止生長(zhǎng)。［8］白菜型油菜品種間雖然存在著一定的差異，但是本實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的矮壯青與黃秧白正反交的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)組合所得到的雜種其性狀是有差異性卻是很小的，其雜交方向并沒(méi)有影響后代的親和性。徐愛(ài)遐等［9］研究了甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜種間雜交親和性發(fā)現(xiàn)，兩種材料正反交后得到的結(jié)果是不一樣的。以芥菜型油菜為母本其它油菜為父本的雜交能夠比較容易地得到雜種，相反，以其它油菜母本、芥菜型油菜為父本的雜交得到后代雜種卻是比較困難的。［10］剛好與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，即以芥菜型油菜為母本、甘藍(lán)型油菜為父本雜交后較容易的得到了其雜種。大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩親本的染色體條數(shù)不一致時(shí)，一般而言，選擇以染色體數(shù)目多的作為母本，染色體數(shù)目少的作為父本，這樣的組合其后代雜種比反交更容易得到，有些反交組合甚至得不到雜種。［11，12］相反，芥菜型油菜染色體數(shù)目36 條，甘藍(lán)型油菜染色體數(shù)目38 條，本實(shí)驗(yàn)以染色體少的芥菜型油菜作為母本染色體數(shù)目多的甘藍(lán)型油菜作為父本，雜交后代比較容易得到。

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