基于朱頂紅愈傷組織途徑誘導(dǎo)形成原球莖的研究

希吉日，田 欣，金牧蘭, 何炎紅*， 田有亮

(1.內(nèi)蒙古呼和浩特市第二中學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010090；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

基于朱頂紅愈傷組織途徑誘導(dǎo)形成原球莖的研究

希吉日1，田 欣1，金牧蘭2, 何炎紅2*， 田有亮2

(1.內(nèi)蒙古呼和浩特市第二中學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010090；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),內(nèi)蒙古呼和浩特 010019)

[目的] 研究通過愈傷組織途徑誘導(dǎo)形成朱頂紅原球莖。[方法]以朱頂紅(Hippeastrumvittatum)鱗莖作為外植體，通過愈傷組織途徑誘導(dǎo)形成原球莖，并建立再生植株。[結(jié)果]誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率達到80%；誘導(dǎo)原球莖增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，誘導(dǎo)原球莖系數(shù)達到15～20個；誘導(dǎo)原球莖生長最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO480 mg/L+TIBA 0.5 mg/L；誘導(dǎo)原球莖生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.5 mg/L，生根率可達100%。[結(jié)論] 建立了朱頂紅再生植株，實現(xiàn)了朱頂紅快速繁殖目標(biāo)，為朱頂紅的種苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

朱頂紅；愈傷組織；原球莖；再生植株

朱頂紅(Hippeastrumvittatum)屬于石蒜科孤挺花屬多年生草本植物[1-2]，又名孤挺花、百支蓮和喇叭花。常見的栽培品種有紅獅子(Red lion)、橙色塞維(Orange Souvereign)、蘋果(Apple Blossom)、蒙特布朗(Mount Blanc)等[3]。朱頂紅原產(chǎn)巴西和南非,喜溫暖濕潤和陽光充足的環(huán)境[4]。屬于球根花卉，地下部分具有鱗莖(Bulbs)，鱗莖是變態(tài)的莖，有短縮而扁盤狀的鱗莖盤，肥厚多肉的鱗葉就著生在鱗莖盤上鱗莖中貯藏豐富的有機物和水分，有利于渡過不利的氣候條件。由于朱頂紅花色艷麗等原因越來越受到國內(nèi)外廣大消費者的喜愛，被廣泛應(yīng)用于盆栽、切花和園林綠化中。朱頂紅還具有解毒消腫、抑制真菌[5]等藥用價值，亦可提取天然食用色素[6]。但朱頂紅栽培品種自花不實,通常采用無性分球法繁殖,繁殖系數(shù)小,且品種極易退化，要解決好這一問題,離體快繁研究的加速發(fā)展,具有重要的現(xiàn)實意義，也是進行工廠化育苗的一條有效途徑。目前，朱頂紅組織培養(yǎng)技術(shù)研究雖然取得了長足發(fā)展，但仍存在繁殖率低、繁殖周期長等問題，限制了朱頂紅組織培養(yǎng)技術(shù)的推廣應(yīng)用，筆者在前人研究朱頂紅組織培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過誘導(dǎo)朱頂紅鱗莖形成愈傷組織，進而形成原球莖，并建立再生植株，實現(xiàn)朱頂紅快速繁殖目標(biāo)，為朱頂紅種苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 基本培養(yǎng)基的篩選選擇生長良好、無病蟲害的朱頂紅為試驗材料，于2012～2013年在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院組織培養(yǎng)實驗室進行研究。選取直徑5～8 cm的鱗莖,用自來水沖凈表層,去除須根、葉和最外一層的鱗莖片。常規(guī)消毒后將鱗莖切成0.5～1.0 cm3大小的方塊,接種于不同濃度的NAA及6-BA MS培養(yǎng)基中,從而篩選出最適的基本培養(yǎng)基。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)采用朱頂紅鱗莖為外植體設(shè)計2種初代愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：①MS+NAA 1.0 mg/L+ 6-BA 2.0 mg/L；②MS+NAA 1.0 mg/L+ 6-BA 1.5 mg/L。將常規(guī)消毒后的鱗莖切塊分別接種到不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每個三角瓶中隨機接種 4 塊，18個重復(fù)，在(25±1)℃下暗培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 原球莖的誘導(dǎo)及增殖將3～4代愈傷組織轉(zhuǎn)接到以下培養(yǎng)基：①MS+NAA 0.1 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L；②MS+NAA 0.1 mg/L+ 6-BA 1.5 mg/L；③MS+NAA 0.1 mg/L+ 6-BA 2.0 mg/L誘導(dǎo)原球莖的發(fā)生。每瓶培養(yǎng)基接種3～4塊愈傷組織，每種培養(yǎng)基18個重復(fù)，光照時間12 h/d，30 d后統(tǒng)計原球莖的發(fā)生率。

1.4 誘導(dǎo)原球莖生長以原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)直徑未能達到1 cm的未感染原球莖作為外植體，接種在附加KH2PO480 mg/L、TIBA 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L和不同濃度6-BA的1/2MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后觀察原球莖生長情況。

1.5 生根及移栽將增殖直徑0.5～0.8 cm的小鱗莖分別接種于附加NAA 0.1 mg/L和不同濃度6-BA的1/2MS培養(yǎng)基中,30 d后觀察原球莖生根狀況。當(dāng)苗高達到3～ 4 cm、根長2～3 cm時進行馴化。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒時間對朱頂紅誘導(dǎo)愈傷組織的影響朱頂紅大球常年生于地下，極易感染紅斑病，帶菌較嚴(yán)重，因此選用2%NaClO試劑對外植體進行處理，應(yīng)用MS培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀測其污染率和愈傷組織誘導(dǎo)和增殖情況。從表1可以看出，消毒時間直接影響愈傷組織的增殖。以污染率低和愈傷組織誘導(dǎo)和增殖狀況正常作為確定消毒時間的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明，鱗莖浸泡8.0 min為最佳消毒時間，其污染率為12.0%，愈傷組織增殖正常。

表1 不同消毒時間的朱頂紅鱗莖消毒效果

表2 6-BA和NAA對朱頂紅鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：基本培養(yǎng)基為MS。

2.2 6-BA對朱頂紅愈傷組織誘導(dǎo)的影響從表2和圖1可以看出，誘導(dǎo)愈傷組織最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率達到80%。

2.3 6-BA對朱頂紅原球莖發(fā)生和增殖的影響將愈傷組織接種到誘導(dǎo)原球莖發(fā)生和增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，結(jié)果表明，6-BA 1.5 mg/L對誘導(dǎo)原球莖有明顯的作用。MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的組合可誘導(dǎo)形成15～20個原球莖，誘導(dǎo)原球莖系數(shù)最大(表3、圖2)。

2.4 6-BA對朱頂紅原球莖生長的影響以原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)直徑未能達到1 cm的未感染原球莖作為外植體，培養(yǎng)在附加KH2PO480 mg/L、TIBA 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L和不同濃度6-BA的1/2MS培養(yǎng)基中，從表4可以看出，當(dāng)NAA濃度不變時，隨著6-BA濃度的增加原球莖直徑有增大趨勢，當(dāng)6-BA濃度達到一定值時，原球莖的直徑出現(xiàn)下降趨勢，培養(yǎng)原球莖生長的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-B A 4.0 mg/L+N A A 0.1 mg/L+K H2P O480 mg/L+T I B A0.5 mg/L，原球莖直徑可達3 cm(圖3)。

注：外植體為鱗莖，基本培養(yǎng)基為MS。

表4 6-BA對朱頂紅原球莖生長的影響

注：外植體為鱗莖，基本培養(yǎng)基MS。

2.5 原球莖誘導(dǎo)生根將直徑3 cm左右未感染的原球莖作為外植體，置于1/2MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 mg/L+瓊脂6 mg/L誘導(dǎo)原球莖生根培養(yǎng)基上，結(jié)果表明培養(yǎng)25 d生根率可達100%(圖4)。

2.6 朱頂紅試管苗的馴化和移栽朱頂紅為球根花卉，在馴化和移栽時，容易成活。在馴化過程中，適當(dāng)增加自然光照時間可以提高移栽成活率。當(dāng)根數(shù)達到2～4條、根長2～4 cm時,可以馴化移栽。先揭開三角瓶瓶口,在培養(yǎng)室內(nèi)放置1 d,然后用鑷子取出植株,洗掉根部附著的培養(yǎng)基,栽于蛭石∶腐殖土∶珍珠巖=1∶1∶1的基質(zhì)上,保持基質(zhì)濕潤, 10 d后小植株成活,成活率可達95%以上(圖5)。

3 結(jié)論與討論

誘導(dǎo)形成原球莖是朱頂紅組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的關(guān)鍵問題，如何快速誘導(dǎo)愈傷組織和原球莖、增加愈傷組織和原球莖增殖數(shù)量成為解決關(guān)鍵問題的重要內(nèi)容。張松等[7]、張亞玲等[8]對朱頂紅組織培養(yǎng)快繁途徑研究指出，不同激素配比的MS培養(yǎng)基,先誘導(dǎo)形成愈傷組織,再形成不定芽或胚狀體，能提高不定芽誘導(dǎo)率。高年春等[9]認為誘導(dǎo)朱頂紅不定芽1/2MS培養(yǎng)基比MS好，并指出在培養(yǎng)基中添加活性炭可以提高不定芽誘導(dǎo)率。這些研究者從不同角度研究了提高不定芽或胚狀體誘導(dǎo)率技術(shù)。在植物組織培養(yǎng)中，再生植物形態(tài)發(fā)生的過程一般劃分為愈傷組織形成和器官發(fā)生2個階段，這2個階段因不同的植物取材部位不同，其培養(yǎng)效果有顯著差異[10-11]。同一植物取自不同器官、組織的外植體，其形態(tài)發(fā)生也有很大差異。該研究認為影響朱頂紅愈傷組織和原球莖誘導(dǎo)率主要因素是激素組合，通過研究不同的激素組合，篩選出能快速誘導(dǎo)愈傷組織和原球莖、提高愈傷組織和原球莖增殖數(shù)量的最佳培養(yǎng)基。該研究表明，MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基能快速從鱗莖誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率也較高(80%)；以MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L為培養(yǎng)基誘導(dǎo)原球莖增殖數(shù)量最佳；原球莖生長培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為 1/2MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO480 mg/L+TIBA 0.5 mg/L。

[1] 韋三立.花卉組織培養(yǎng)[M].北京:中國林業(yè)出版社,2001

[2] 姜明蘭，鐘文田.朱頂紅愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊,1984(1):37-38.

[3] 張松，達克東，曹辰興，等.朱頂紅離體培養(yǎng)快速繁殖體系及杯壯體發(fā)生[J].園藝報，2002,29(3):285-287.

[4] 王紅芳,賈春蘭.園藝植物組培苗工廠化生產(chǎn)(三)—優(yōu)良品種的快速繁殖[J].農(nóng)村實用工程技術(shù),1996(1):2.

[5] 魯紅學(xué),彭躍峰,熊定志. 朱頂紅鱗莖提取物的抑菌作用研[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006(9):1906-1907.

[6] 蔣新龍,蔣益花.朱頂紅花紅色素的提取條件及理化性質(zhì)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2006,18(2):113-117.

[7] 張松,達克東,曹辰興.朱頂紅離體培養(yǎng)快速繁殖體系及胚狀體發(fā)生[J].園藝學(xué)報,2002(3):285-287.

[8] 張亞玲,張延龍,原雅玲.6BA和NAA對朱頂紅組織培養(yǎng)的影響[J].陜西林業(yè)科技,2006(1):7-9.

[9] 高年春,楊 怡,曹榮祥.幾個雜交朱頂紅品種不定芽誘導(dǎo)試驗[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2003(6):80-82.

[10] 曹孜義. 實用組織培養(yǎng)技術(shù)教程[M].蘭州: 甘肅科技出版社,2001.

[11] 王愛勤，周歧偉，何龍飛，等. 百合試管結(jié)鱗莖的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998, 17(1):71-75.

Research on the Protocorm Inducer fron Callus ofHippeastrumvittatum

XI Ji-ri1, TIAN Xin1, JIN Mu-lan2,HE Yan-hong2*et al

(1.No.2 Middle School of Hohhot, Hohhot, Inner 010090; 2.Forestry College，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot, Inner 010019)

[Objective] The aim was to study the development ofHippeastrumvittatumby callus induced using bulbs as explants. [Method]Callus were induced using bulbs as explants then the protocorm was developed and regeneration plants were established. [Result]The results showed that the optimal medium for callus induction was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L, the callus induction rate of bulbs was the highest, the induction rate reached 80%; medium to induce proliferation of protocorm like bodies was MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L, inducing protocorm coefficient could reach 15-20; the optimal medium of protocorm growth was 1/2 MS+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ KH2PO480 mg/L+TIBA 0.5 mg/L;Induction of protocorm rooting medium was 1/2 MS+IBA 0.5mg/L,the rooting rate was up to 100%. [Conclusion] Regeneration plant ofHippeastrumvittatumwas established, and realize the fast breeding goal, in order to provide technical support for seedlings production.

Hippeastrumvittatum；Callus；Protocorm；Regenerated plant

內(nèi)蒙古自治區(qū)科學(xué)技術(shù)廳項目(20130438)。

希吉日(1997- ) ，女，蒙古族，內(nèi)蒙古呼和浩特人，內(nèi)蒙古呼和浩特市第二中學(xué)在讀學(xué)生。*通訊作者，副教授，博士，從事林木培育方面的研究。

2015-03-23

S 682.2+5

A

0517-6611(2015)13-051-04