馬 迪,向 陽,王 丹,常軍民*(.新疆醫(yī)科大學藥學院,烏魯木齊 8300;.新疆醫(yī)科大學一附院,烏魯木齊830054)
天山花楸果實和枝葉提取物的藥效比較研究
馬 迪1,向 陽2,王 丹1,常軍民1*(1.新疆醫(yī)科大學藥學院,烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學一附院,烏魯木齊830054)
目的 比較天山花楸果實醇提液和天山花楸枝葉醇提液的平喘、祛痰、抗炎及免疫作用。方法 采用磷酸組胺致豚鼠哮喘實驗、大鼠毛細管排痰實驗、角叉菜膠致大鼠足腫脹實驗和碳粒廓清和血清溶血素的測定實驗,評價果實和枝葉提取物的作用。結果 天山花楸枝葉醇提物各劑量組的平喘效果明顯優(yōu)于相同劑量的果實組枝葉醇提物8和12g·kg-1劑量組的排痰效果優(yōu)于相同劑量的果實組(P<0.05);天山花楸枝葉醇提物的抗炎效果也明顯高于同劑量的果實組(P<0.05);天山花楸枝葉提取物各劑量組的免疫作用與相同劑量的果實組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 天山花楸枝葉提取物的平喘、祛痰、抗炎及免疫調節(jié)作用明顯優(yōu)于其果實提取物。
天山花楸果實醇提液;天山花楸枝葉醇提液;平喘;祛痰;抗炎;免疫
天山花楸(Sorbus tianshanica Rupr.)系薔薇科Rosacea花楸屬Sorbus植物,主要分布在西南、西北等地區(qū)。新疆花楸資源豐富,維吾爾族和哈薩克族民間常以其果實、嫩枝葉及莖皮入藥,用于治療慢性支氣管炎、咳嗽、胃炎、維生素A和維生素C缺乏癥等[13]。國內(nèi)多位學者曾對天山花楸全株植物進行不同提取部分的化學成分及藥理作用[4]的相關研究,但未見其果實及枝葉的藥理作用比較研究。本實驗從天山花楸果實和枝葉中總黃酮和總氰苷的含量差異
出發(fā),對天山花楸果實醇提物和枝葉醇提物的平喘、祛痰、抗炎及免疫作用進行了系統(tǒng)地藥效學比較研究。
1.1 儀器 402型超聲霧化器(上海合力醫(yī)療器械廠);TD5A-WS-離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);s22PC-可見分光光度計(上海棱光技術有限公司);XS205型電子分析天平(托利多-梅特勒有限公司);JB/T 5347-1991-電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。
1.2 試藥 天山花楸為薔薇科花楸屬植物,于2013年7月中旬購自新疆呼圖壁林場,秋季葉尚綠時采收,即時干燥,經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院生藥學教研室帕麗達教授鑒定為天山花楸(Sorbus tianschanica Rupr.)的干燥嫩枝葉;乙醇(天津富宇精細化工有限公司,批號120227);氨茶堿(北京中興制藥廠,批號120901);磷酸組胺(上海藍季科技發(fā)展有限公司,批號120318);氯化乙酰膽堿(上海試劑三廠,批號971205);桂龍咳喘寧膠囊(山西桂龍醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),批號040805);地塞米松磷酸鈉注射液(天津金耀集團湖北天藥藥業(yè)股份有限公司,批號201307251);氯化銨(天津市北方天醫(yī)化學試劑廠,分析純);印度墨汁(Blank Indian Ink)用生理鹽水將其稀釋5倍后超聲波處理,離心,取上清液;綿羊紅細胞(批號20130623)。
1.3 動物 SD大鼠,體質量200±20g;豚鼠,體質量250±20g;昆明種小鼠,體質量18~22g,實驗動物均由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK2011(新)-0004,實驗動物使用許可證號SCXK2011(新)-0004。
2.1 提取物制備
2.1.1 天山花楸果實醇提液[5]稱取一定質量天山花楸干燥果實,粉碎,過20目篩,溶劑為體積分數(shù)40%乙醇,料液比1∶15,50℃條件下回流提取2次,每次1.5h,抽濾,合并濾液,濃縮至1mL相當于1.2g生藥的藥液,-20℃冰箱冷藏備用。實驗時配成所需質量濃度,灌胃給藥。
2.1.2 天山花楸枝葉醇提液[6]稱取一定質量天山花楸干燥枝葉,溶劑為體積分數(shù)40%乙醇,料液比1∶15,40℃條件下回流提取3次,每次1h。抽濾,合并濾液,濃縮至1mL相當于1.2g生藥的藥液,-20℃冰箱冷藏備用。實驗時配成所需質量濃度,灌胃給藥。
2.2 平喘實驗 采用豚鼠磷酸組胺引喘法[7],將豚鼠逐一放在4 000mL透明的密閉玻璃鐘罩內(nèi),用超聲霧化器噴入引喘藥液(20g·L-1氯化乙酰膽堿與1g·L-1磷酸組織胺的等量混合液)15s,立即觀察并記錄豚鼠的引喘潛伏期(從噴霧開始到哮喘發(fā)作,出現(xiàn)呼吸困難,直至抽搐跌倒的時間)。150s內(nèi)出現(xiàn)喘息性抽搐的為合格的敏感動物。選取90只合格的豚鼠,雌雄兼用,隨機分為9組:即陰性對照組,給等容積蒸餾水;天山花楸果實低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1);天山花楸枝葉低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1);陽性對照組氨茶堿(0.114g·kg-1);桂龍咳喘寧組(2g·kg-1)。每組10只,各組皆灌胃給藥,1次·d-1,均為1mL·kg-1,連續(xù)7d。末次給藥1h后按預選方法測定并記錄豚鼠的引喘潛伏期。若超過6min仍不發(fā)生哮喘反應者,其潛伏期按360s計算。
2.3 排痰實驗 采用大鼠毛細管祛痰法[8],取SD大鼠90只,雌雄各半,隨機分為9組,每組10只??瞻捉M給等容積蒸餾水灌胃,陽性對照組灌胃給予氯化銨溶液(1g·kg-1),桂龍咳喘寧對照組(2g·kg-1),天山花楸果實低、中、高劑量組(4,8,12g·kg-1),天山花楸枝葉低、中、高劑量組(4,8,12g·kg-1)。各組皆灌胃給藥,1次·d-1,劑量為1mL·kg-1,連續(xù)7d。末次給藥前1d,動物禁食不禁水8~12h;末次給藥30min后用戊巴比妥鈉(30mg·kg-1)腹腔注射麻醉后,仰位固定,剪開頸中部皮膚,分離出氣管,在甲狀軟骨下緣上中兩軟骨環(huán)之間用尖銳的注射針尖扎一小孔,然后向氣管內(nèi)向心方向插入內(nèi)徑0.5mm、長10cm玻璃毛細管1根,使毛細管剛好接觸氣管底部表面,以吸取氣管后部之痰液,(調整毛細管與氣管之間的角度)玻璃毛細管應往頭部傾斜60°。記錄給藥前2h的正常分泌量(以占毛細管長度計),并比較組間差異性。
2.4 抗炎實驗 采用角叉菜膠致大鼠足腫脹法[9],取SD種健康雄性大鼠80只,隨機分為8組:分別為生理鹽水陰性對照組,天山花楸果實低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1),天山花楸枝葉低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1),陽性對照組為桂龍咳喘寧組(2g·kg-1)。各組連續(xù)灌胃給藥7d,每天1次,均為1mL·kg-1,先用容積法測量大鼠右后足體積。于末次給藥后1h注射10g·L-1角叉菜膠溶液于大鼠右后足致炎(0.1mL/足),再分別于致炎后1,2,3,4和6h在已標記處用同法測量1次大鼠右后足的容積,并記錄致炎后大鼠的足腫脹度。
2.5 免疫實驗
2.5.1 炭粒廓清法[10]取昆明種小鼠80只,雌雄各半,隨機分成8組,每組10只??瞻讓φ战M給相應體積的蒸餾水,地塞米松陽性對照組(1.4×10-3g·kg-1),天山花楸果實低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1),天山花楸枝葉低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1)。1次·d-1,連續(xù)10d,劑量為0.02mL·g-1,末次給藥1h后,從小鼠尾靜脈注射體積分數(shù)為20%印度墨汁0.001mL·g-1,墨汁一經(jīng)注入,立即計時。于注射后2min(t1)和10min(t2)分別從小鼠眼眶靜脈叢取血0.02mL,將取出的血液加到2mL質量濃度為1g·L-1碳酸鈉溶液中,搖勻,用721分光光度計,在600nm波長處測定吸光度,記錄吸光度A值。取血后頸椎法處死動物,取出小鼠的肝臟與脾臟,稱質量。按下式計算廓清吞噬指數(shù)(K)及校正吞噬系數(shù)(α)。
K=lgA1-lgA2/(t2-t1)
α=體質量/(肝質量+脾質量)×K1/3
2.5.2 血清溶血素法[11]昆明種小鼠80只,體質量18~22g,隨機分成8組,每組10只??瞻讓φ战M給相應容量的蒸餾水,地塞米松陽性對照組(1.4× 10-3g·kg-1),天山花楸果實低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1);天山花楸枝葉低、中、高劑量組(4,8和12g·kg-1)。先灌胃給藥,1次·d-1,連續(xù)7d,在第7d對小鼠進行免疫。將綿羊紅細胞(SRBC)用生理鹽水洗滌3次后,配成2mL·L-1SRBC溶液,每只小鼠腹腔注射0.2mL,連續(xù)5d,第5天給藥后2h從小鼠眼眶后靜脈叢取血,離心得血清,取20μL血清用生理鹽水稀釋500倍,取1mL,再加入2mL·L-1SRBC溶液、補體(1∶10稀釋的混合豚鼠血清)和生理鹽水各0.5mL,于溫箱內(nèi)溫0.5h后,以3 000r·min-1離心10min,取上清液于540nm處測定吸光度A值,并計算半數(shù)溶血值(HC50)。
2.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,實驗數(shù)據(jù)用x±s單次測量標準差表示,組間比較采用方差分析進行差異顯著性比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
3.1 組胺引喘實驗 天山花楸果實、枝葉醇提物各劑量組、氨茶堿組以及桂龍咳喘寧組與空白對照組相比,均能顯著延長豚鼠的引喘潛伏期(P<0.05);天山花楸枝葉醇提物各劑量組的平喘效果明顯優(yōu)于相同劑量的果實組(P<0.05),并且天山花楸枝葉和果實高、中劑量組對豚鼠引喘潛伏期的延長作用明顯優(yōu)于桂龍咳喘寧組和氨茶堿組(P<0.01)。結果見表1。
表1 天山花楸果實、枝葉醇提物對豚鼠的平喘作用對比Tab.1 The antiasthma effect comparison between the ethanol extract from Sorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in guinea pigs ±s,n=10)
表1 天山花楸果實、枝葉醇提物對豚鼠的平喘作用對比Tab.1 The antiasthma effect comparison between the ethanol extract from Sorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in guinea pigs ±s,n=10)
注:與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01;與同劑量果實提取物比較3)P<0.05,4)P<0.01;與氨茶堿組比較5)P<0.05,6)P<0.01;與桂龍咳喘寧組比較7)P<0.05,8)P<0.01。
組別 劑量/g·kg-1引喘潛伏期/s延長時間/s 134.98 NS - 45.35±14.46天山花楸果實 12 238.50±25.542)6)8)193.50 8 145.23±21.342)6)8) 99.88 4 51.60±31.766)8) 6.25天山花楸枝葉 12 300.05±22.322)6)8)255.70 8 226.12±22.122)4)6)8)180.75 4 97.64±19.781)4)6)8)52.29氨茶堿組 0.114 178.83±18.452) 133.48桂龍咳喘寧組 2 180.33±24.562)
3.2 大鼠毛細管排痰實驗 研究表明,天山花楸果實、枝葉各劑量組及氯化銨組、桂龍咳喘寧組與空白對照組比較,均能增加大鼠的排痰量(P<0.01);與同劑量天山花楸果實醇提物相比,枝葉高、中劑量組能明顯提高大鼠的排痰量(P<0.05);且天山花楸枝葉醇提物高劑量組的排痰效果均明顯優(yōu)于陽性藥組和桂龍咳喘寧組(P<0.01),結果見表2。
表2 天山花楸果實、枝葉醇提物對大鼠的祛痰作用對比Tab.2 The phlegm dispelling effect comparison between the ethanol extract from Sorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in rats ±s,n=10)
表2 天山花楸果實、枝葉醇提物對大鼠的祛痰作用對比Tab.2 The phlegm dispelling effect comparison between the ethanol extract from Sorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in rats ±s,n=10)
注:與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01;與同劑量果實提取物比較3)P<0.05,4)P<0.01;與氯化銨組比較5)P<0.05,6)P<0.01;與桂龍咳喘寧組比較7)P<0.05,8)P<0.01。
組別 劑量/g·kg-1 痰量/mm NS - 5.67±0.32天山花楸果實 12 8.30±0.232)6)8)8 6.90±0.781)6)8)4 5.37±0.476)8)天山花楸枝葉 12 17.10±0.752)4)6)8)8 14.30±0.252)4)6)8)4 7.90±0.792)4)6)8)氯化銨組 1 15.07±0.412)桂龍咳喘寧組 2 13.20±0.852)
3.3 大鼠足趾腫脹實驗 結果顯示,天山花楸果實、枝葉醇提物各劑量組以及桂龍咳喘寧組在不同時間點內(nèi)對抑制10g·L-1角叉菜膠溶液所致的大鼠足腫脹有不同的作用強度(P<0.05,P<0.01);天山花楸枝葉醇提物高劑量組在2,3,4和6h,中劑量組在2和4h的抗炎效果明顯高于同劑量的果實組(P<0.05,P<0.01);與桂龍咳喘寧組對比,均無明顯差異,結果見表3。
3.4 對小鼠碳粒廓清指數(shù)和溶血素的影響 結果如表4所示,與正常組相比,天山花楸果實、枝葉提取物高、中劑量組及地塞米松組均可提高小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)(P<0.05);天山花楸枝葉提取物高、中劑量組的吞噬指數(shù)a與相同劑量的果實組相比,有明顯差異(P<0.05)。各實驗組與空白對照組相比,能顯著升高小鼠的血清溶血素的生成(P<0.05);天山花楸枝葉提取物各劑量組的血清溶血素的生成提高效果明顯優(yōu)于相同劑量的果實組(P<0.05);且天山花楸枝葉提取物各劑量組提高小鼠的血清溶血素的生成的效果與陽性藥地塞米松相比,也有顯著提高(P<0.05)。
表3 天山花楸果實、枝葉醇提物對大鼠的抗炎作用對比Tab.3 The anti-inflammatory effect comparison between the ethanol extracts fromSorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in rats (±s,n=10)
表3 天山花楸果實、枝葉醇提物對大鼠的抗炎作用對比Tab.3 The anti-inflammatory effect comparison between the ethanol extracts fromSorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in rats (±s,n=10)
注:與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01;與同劑量果實提取物比較3)P<0.05,4)P<0.01;與桂龍咳喘寧組比較5)P<0.05,6)P<0.01。
組別 劑量/g·kg-1mL 1 2 3 4 6 NS - 0.636±0.046 0.251±0.085 0.466±0.086 0.5 mL給藥前/不同時間(h)足腫脹度/67±0.105 0.583±0.087 0.573±0.104天山花楸果實 12 0.657±0.056 0.185±0.070 0.312±0.1011)0.407±0.0711)0.502±0.0471)0.507±0.067 8 0.630±0.049 0.196±0.063 0.343±0.0821)0.425±0.0681)0.516±0.0881)0.519±0.092 4 0.686±0.039 0.199±0.057 0.392±0.0661)0.429±0.0681)0.531±0.098 0.507±0.093天山花楸枝葉 12 0.621±0.062 0.166±0.0681)0.270±0.0882)0.372±0.0672)0.427±0.0712)3)0.417±0.0891)3)8 0.644±0.077 0.169±0.0731)0.282±0.0942)0.417±0.0891)0.437±0.1082)0.446±0.0751)4 0.658±0.048 0.180±0.069 0.325±0.0981)0.424±0.0861)0.445±0.1041)0.430±0.0681)桂龍咳喘寧組 2 0.649±0.037 0.175±0.0711)0.277±0.1032)0.404±0.0912)0.496±0.0921)0.486±0.094
表4 天山花楸果實、枝葉醇提物對小鼠的免疫作用對比Tab.4 The comparison of immune action between the ethanol extract fromSorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in rats (±s,n=10)
表4 天山花楸果實、枝葉醇提物對小鼠的免疫作用對比Tab.4 The comparison of immune action between the ethanol extract fromSorbus tianshanica Rupr.fruits and stems or leaves in rats (±s,n=10)
注:與對照組比較1)P<0.05,2)P<0.01;與同劑量果實提取物比較3)P<0.05,4)P<0.01;與地塞米松組比較5)P<0.05,6)P<0.01。
組別 劑量/g·kg-1碳粒廓清測定廓清指數(shù)K 吞噬指數(shù)a溶血素測定HC50NS - 0.031 0±0.021 3 4.563±0.891 98.803±11.855天山花楸果實 12 0.040 0±0.008 31) 5.182±0.7871) 145.443±12.7052)5)8 0.033 5±0.010 62) 4.507±0.9646) 142.155±12.0202)5)4 0.029 2±0.009 72)5) 4.028±0.8096) 134.384±11.2162)天山花楸枝葉 12 0.042 6±0.007 62) 5.928±1.0092)3) 159.134±8.8722)3)6)8 0.038 4±0.011 31) 5.328±1.0132)4) 153.190±9.9322)3)6)4 0.030 1±0.009 56) 4.617±0.9096) 141.402±10.0952)4)5)地塞米松 1.4×10-3 0.042 1±0.010 52) 5.686±0.8912) 130.880±10.3002)
支氣管哮喘是由肥大細胞、嗜酸性細胞和T淋巴細胞等參與的慢性氣道炎癥,咳嗽、多痰、喘息為支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的常見癥狀。目前應對哮喘癥狀臨床多以糖皮質激素抗炎治療為主,但長期應用不良反應顯而易見,所以亟待解決的問題是能找到新的替代藥物。天山花楸藥材中的多種有效成分,具有祛痰、平喘、調節(jié)免疫力和抗炎等藥理功效。
從實驗結果可知,天山花楸枝葉醇提物組的藥效明顯優(yōu)于同劑量果實組,其原因可能是:天山花楸中主要有效成分為黃酮及氰苷類化合物,文獻報道其果實和枝葉中總黃酮的含量分別為54.29和69.07mg·g-1,總氰苷的含量分別為0.25和2.81mg·g-1[5-6,12-13],從實驗數(shù)據(jù)可以看出,枝葉中的有效成分含量均高于果實。果實醇提物的藥效雖低于枝葉,但與空白對照組相比也有顯著差異,且具有統(tǒng)計學意義。本實驗首次從藥理學方向驗證了天山花楸枝葉醇提物的平喘、祛痰、抗炎及免疫調節(jié)作用均優(yōu)于其果實提取物,為日后天山花楸藥材的合理應用提供了科學依據(jù)。
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Pharmacodynamic comparison between ethanol extracts from Sorbus tianshanica Rupr.fruits,stems and leaves
MA Di1,XIANG Yang2,WANG Dan1,CHANG Junmin1*(1.College of Pharmacy,Xinjiang University,Urumqi 830011,China;2.the First Affiliated Hospital of Xinjiang University,Urumqi 830054,China)
Objective Experiments were carried out to identify the antiasthmatic,expectorant,anti-inflammatory and immunity effects between Sorbus tianshanica Rupr.fruits ethanol extracts and Sorbus tianshanica Rupr.stems and leaves ethanol extracts.Methods The antiasthma effects were studied by the latent period of asthma which was induced by acetylcholine chloride and histamine phosphate in guinea pigs.The phlegm dispelling effects were observed by the capillary expectoration method.The anti-inflammatory effects were investigated through the experiment of paw edema of rats caused by carrageenin.Carbon clearance and hemolysin immune evaluation were also carried out in mice.Results The alcohol extract fromSorbus tianshanicastems and leaves of each dose group′s anti-asthmatic action was significantly better than the same dose group of the fruit extract(P<0.05).The alcohol extract fromSorbus tianshanica Rupr.stems and leaves of 8and 12g·kg-1dose group′s phlegm dispelling effects had an advantage over the same dose group of the fruit extract(P<0.05).Sorbus tianshanica Rupr.stems and leaves alcohol extract′s anti-inflammatory effect was superior to the same dose group of the fruit extract(P<0.05).The alcohol extract of Sorbus tianshanica Rupr.stems and leaves of each dose group′s immunological regulative functions was differerent from the fruit extract(P<0.05).Conclusion For relieving asthma,expelling phlegm,resisting inflammation and immunological regulative functions,the branches and leaves extract of Sorbus tianshanica Rupr.is better than the fruits extract.
Sorbus tianshanica Rupr.fruits ethanol extracts;Sorbus tianshanica Rupr.stems and leaves ethanol extract;antiasthmatic;expectorant;anti-inflammatory;immunity
10.3969/j.issn.1004-2407.2015.01.012
R965
A
1004-2407(2015)01-0043-05
2014-07-01)
新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計劃(編號201133127)
馬迪,碩士,研究員
*通信作者:常軍民,博士,教授