HPLC法測定抗結(jié)核病藥物四味抗癆丸中巴豆苷的含量

邱遠(yuǎn)金，朱國強(qiáng)＊，賈曉光，陳書強(qiáng)，李忠民（.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 83000；.上海蒼龍生物科技發(fā)展有限公司，上海 00063）

HPLC法測定抗結(jié)核病藥物四味抗癆丸中巴豆苷的含量

邱遠(yuǎn)金1，朱國強(qiáng)1＊，賈曉光1，陳書強(qiáng)2，李忠民2（1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002；2.上海蒼龍生物科技發(fā)展有限公司，上海 200063）

目的 建立高效液相色譜法測定四味抗癆丸中巴豆苷含量。方法 采用高效液相色譜法測定四味抗癆丸中巴豆苷的含量。色譜柱為Luna C18柱，流動(dòng)相為乙腈－甲醇－水（1∶4∶95），檢測波長為292nm，流速為1.0mL·min－1。結(jié)果 巴豆苷在6.195×10－2～1.239μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，r＝0.999 9（n＝7），平均回收率為98.4%，RSD為1.0%，經(jīng)測定供試品中巴豆苷平均含量為0.207 3mg·g－1。結(jié)論 該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于四味抗癆丸中巴豆苷含量測定。

四味抗癆丸；巴豆苷；高效液相色譜法；結(jié)核病

中國是全球22個(gè)肺結(jié)核高負(fù)擔(dān)國家之一，肺結(jié)核患者數(shù)量居世界第1位；據(jù)全國法定傳染病報(bào)告，結(jié)核病報(bào)告發(fā)病人數(shù)始終位居法定報(bào)告甲、乙類傳染病前列，衛(wèi)生部將結(jié)核病列為全國重點(diǎn)控制的重大疾病之一［1］。目前主要采用西藥治療結(jié)核病，常伴隨對患者肝臟及其他臟器損傷的不良反應(yīng)和毒副作用，也出現(xiàn)耐藥性，在一定程度和范圍內(nèi)西藥失去其已有的治療效果［2－4］，因此，抗結(jié)核病新藥研發(fā)尤其從中藥中篩選抗結(jié)核病藥物具有重要意義。四味抗癆丸是在傳統(tǒng)藥方的基礎(chǔ)上研制開發(fā)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑（批準(zhǔn)文號：新藥制字Z20120005），屬純中藥復(fù)方，由巴豆霜等四味中藥組成，具有滋陰清火、養(yǎng)血斂陰、消腫生肌功效，用于治療肺結(jié)核、骨與關(guān)節(jié)結(jié)核、淋巴結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎等結(jié)核病。其中巴豆霜性辛、熱，歸胃、大腸經(jīng)，有峻下冷積、逐水退腫、豁痰利咽、抗結(jié)核桿菌的功效［5］；主要用于瀉下寒積、逐水消腫、祛痰利咽及外用蝕瘡、惡瘡疥癬。本研究采用高效液相色譜法測定四味抗癆丸中巴豆苷的含量，為有效控制制劑質(zhì)量和保障用藥安全提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SK5200HP超聲儀（59Hz，200W）；Metter EL104電子分析天平；LC－2010CHT型高效液相色譜儀（島津）。

1.2 試藥 巴豆苷對照品（批號111856－201001）購自中國食品藥品檢定研究院。四味抗癆丸（每10丸質(zhì)量1g，批號20120412，20120413，20120414）。色譜乙腈、色譜甲醇、乙醚、純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Luna C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－甲醇－水（1∶4∶95）；檢測波長：292nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min－1；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 系統(tǒng)適用性 分別取對照品溶液、供試品溶液，缺巴豆霜的陰性供試品溶液，各取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，巴豆苷對照品與四味抗癆丸中巴豆苷的保留時(shí)間一致，陰性供試品溶液在相應(yīng)位置處未出現(xiàn)巴豆苷吸收峰，且巴豆苷色譜峰與其他組分色譜峰分離完全。理論板數(shù)按巴豆苷峰計(jì)算不低于5 000。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取巴豆苷對照品適量，置于10mL量瓶中，加水溶解，定容至刻度，得質(zhì)量濃度61.95μg·mL－1對照品溶液。

2.4 供試品溶液制備 取四味抗癆丸樣品粉末（過三號篩）約3g，精密稱定，置于索氏提取器中，加乙醚50mL，加熱回流3h，棄去乙醚液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，精密加水50mL，稱定質(zhì)量，超聲處理20min，放冷，再稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

圖1 HPLC圖A.對照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.巴豆苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.crotonside

2.5 陰性樣品 除巴豆霜以外，其余藥按四味抗癆丸處方與制法制成陰性樣品，再按2.4項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。吸取對照品、供試品及陰性對照溶液注入色譜儀，照上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，陰性對照溶液中在巴豆苷峰的出峰位置處未出現(xiàn)吸收峰，表明處方中其他藥材對巴豆苷的含量測定無干擾。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別精密吸取上述對照品溶液1，2，4，8，10，12和20μL注入色譜儀，在上述色譜條件下測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、巴豆苷質(zhì)量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝2×106X＋413.7（r＝0.999 9），線性范圍：6.195×10－2～1.239μg。

2.7 精密度 吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件操作，測其峰面積，以峰面積計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD為0.05%，表明此方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液10μL，按上述色譜條件，在0，2，4，8，16和24h測定巴豆苷峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果RSD為0.82%。結(jié)果表明，此方法穩(wěn)定性較好。

2.9 重復(fù)性 準(zhǔn)確稱取同批次供試品6份，按2.4項(xiàng)下方法操作制備供試品溶液，并測定巴豆苷含量，結(jié)果平均含量為0.208 1mg·g－1，RSD為1.74%（n＝6），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此方法重復(fù)性較好。

2.10 回收率 采用加樣回收法。稱取同一批次樣品5份，按照2.4項(xiàng)下方法操作，取樣品溶液1mL，分別置于測試瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為61.95μg·mL－1對照品溶液0.2mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作中峰面積測定方法進(jìn)行操作，計(jì)算，平均回收率為98.4%，RSD為1.0%，結(jié)果表明此方法回收率良好。

2.11 樣品含量測定 取3批樣品，按上述色譜條件和方法測定巴豆苷的含量。結(jié)果3批樣品（批號分別為20120412，20120413，20120414）的含量分別為0.206 2，0.209 6和0.205 9mg·g－1，平均含量為0.207 3mg·g－1。

根據(jù)上述測定結(jié)果，1g樣品含巴豆霜以巴豆苷（C10H13N5O5）計(jì)，不得少于0.14mg。

3 討論

結(jié)核病是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，已成為全球重大的公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題［6］。根據(jù)2011年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告及新疆結(jié)核病監(jiān)測報(bào)告結(jié)果顯示，新疆結(jié)核病發(fā)病形勢呈現(xiàn)出復(fù)雜、耐藥、難治性結(jié)核病人增多、結(jié)核病合并艾滋病雙重感染病人增多等特點(diǎn)，結(jié)核病對新疆社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了重大影響［7］。四味抗癆丸作為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑在新疆多所醫(yī)院使用，在治療和控制新疆結(jié)核病方面起到了較好的作用。

從處方組成看，巴豆霜作為處方主要組成成分之一，主要含有：脂肪油（即巴豆油，為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、巴豆油酸、巴克酸等的甘油酯），蛋白質(zhì)（含巴克毒素crotin），巴克樹脂（為瀉下成分，是巴克豆醇phorbol、甲酸、丁酸、巴克油酸等結(jié)合而成的酯），生物堿，巴豆苷等［8］，巴豆苷是巴豆霜中典型成分之一，具有多種生物活性和藥理活性，具有抗結(jié)核桿菌的作用［5，910］；因此，測定有效成分巴豆苷含量對控制四味抗癆丸質(zhì)量具有重要意義，選擇巴豆苷為定量測定指標(biāo)。本研究采用HPLC法對3批供試品中巴豆苷含量進(jìn)行測定，3批樣品的含量分別為0.206 2，0.209 6和0.205 9mg·g－1，平均含量為0.207 3mg·g－1。根據(jù)測定結(jié)果，1g樣品含巴豆霜以巴豆苷（C10H13N5O5）計(jì)，不得少于0.14mg。高效液相色譜法常用于測定藥物中有效成分［11－12］，具有方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的特點(diǎn)，該方法可用于四味抗癆丸中巴豆苷含量測定。

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Determination of crotonside in the anti－tuberculosis drug Siweikanglao Pills by HPLC

QIU Yuanjin1，ZHU Guoqiang1＊，JIA Xiaoguang1，CHEN Shuqiang2，LI Zhongmin2（1.Xinjiang Institutes of Traditional Chinese Medica and National Medica，Urumqi 830002，China；2.Biological Technology Development Limited Company of Shanghai Canglong，Shanghai 200063，China）

Objective To establish an HPLC method for the determination of crotonside in Siweikanglao Pills.Methods HPLC analysis was carried out on a Luna C18column and a mixture of acetonitrile－methanol－water（1∶4∶95）was used as the mobile phase，with the detection wavelength at 292nm，and the flow rate at 1.0mL·min－1.Results The linear range of crotonside was from 6.195×10－2to 1.239μg.The correlation coefficient of the calibration curves was 0.999 9.The average recovery rate was 98.4% with relative standard deviation of 1.0%.The average content in Siweikanglao Pills was 0.207 3mg·g－1.Conclusion The results showed that the method is simple，accurate and repeatable，and it is suitable for the quality control of Siweikanglao Pills.

Siweikanglao Pills；crotonside；HPLC；anti－tuberculosis

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.009

R282

A

1004－2407（2015）01－0028－03

2014－07－22）

新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（編號：201233137）

邱遠(yuǎn)金，男，助理研究員

＊通信作者：朱國強(qiáng)，男，研究員