青龍衣水解單寧含量測定方法研究

姜 蕊，張 霞，邢 丹，劉子禎，劉偉銳，楊 悅，王曉宏，折改梅（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系，北京 100102）

青龍衣水解單寧含量測定方法研究

姜 蕊，張 霞，邢 丹，劉子禎，劉偉銳，楊 悅，王曉宏，折改梅＊（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系，北京 100102）

目的 建立青龍衣水解單寧含量測定的方法。方法 以沒食子酸為對照品，研究青龍衣水解單寧的含量測定，采用紫外－可見分光光度法，確定改良的Folin－Ciocalteu法運(yùn)用于青龍衣單寧含量測定顯色的最佳條件，測定青龍衣酸解前后總單寧的含量。結(jié)果 測定沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝151.8 X＋0.041，在0.992～4.960μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r＝0.999（n＝6）。優(yōu)化的顯色方法為1.0mL的樣品液，F(xiàn)olin－Ciocalteu 1.5mL，加去離子水10mL，用70g·L－1的碳酸鈉定容至25 mL，30℃顯色1.5h。結(jié)論 該顯色方法操作簡便，準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，既適用于未酸解單寧樣品的含量測定，也適用于酸解后單寧樣品的含量測定，對水解單寧類成分的含量測定具有普遍適用性。

青龍衣；單寧；酸解；紫外－可見分光光度法

青龍衣是胡桃科胡桃屬植物核桃（Juglans regia Linn.）未成熟果實(shí)的干燥果皮，主產(chǎn)于東北、山東、河北等地，為民間常用中藥［1－2］。青龍衣中含有萘醌類及其衍生物、黃酮類、二芳基庚烷類和大量水解型單寧［3］。其單寧物質(zhì)有抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛等多種功效［45］。再者，青龍衣有較強(qiáng)的著色功能，其色素物質(zhì)基礎(chǔ)初步認(rèn)定是水解單寧類成分［6］。但是，迄今為止關(guān)于青龍衣單寧含量測定方法卻未見詳細(xì)報(bào)道。

中藥水解單寧含量測定方法有酒石酸亞鐵法、高錳酸鉀法和普魯士蘭法［7－9］，多采用醇提物制備供試品，也有采用酸水解樣品醇提取物的報(bào)道［7－9］。但并未考慮其水解前后2種供試品制備方法是否會對分光光度法的波長和顯色條件有顯著影響。

鑒于此，筆者對富含單寧類成分的青龍衣水解單寧含量測定方法進(jìn)行了研究，采用紫外－可見分光光度法，確定了改良的Folin－Ciocalteu法運(yùn)用于青龍衣單寧含量測定顯色的最佳條件，并測定了青龍衣酸解前后總單寧的含量。

本文所建立的顯色方法操作簡便、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，對水解單寧類成分的含量測定具有普遍適用性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UNICO UV－2000紫外分光光度計(jì)（尤尼柯上海公司）；KQ－40KDE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；DK－S24電熱恒溫水浴鍋（上海精

宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Sartorious BT 25S1／10 000和Sartorious BS 124S1／10 000電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥 核桃青皮采自北京昌平，經(jīng)本文作者鑒定為胡桃科胡桃屬植物核桃（Juglans regia Linn.）的外果皮，將其陰干后制得青龍衣。沒食子酸對照品（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%，批號為20120418）；無水碳酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、鹽酸、硫酸鋰、甲醇（均為分析純，北京化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 福林試劑的配制 于500mL的圓底燒瓶中加入鎢酸鈉20g、鉬酸鈉5g、蒸餾水140mL、體積分?jǐn)?shù)85%的磷酸10mL、濃鹽酸20mL，文火回流10h，去冷凝管，加入硫酸鋰10g，蒸餾水10mL，混勻，加入幾滴液體溴，煮沸15min，以驅(qū)逐殘溴及除去顏色，溶液呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴溴，再煮沸除去。冷卻后，過濾，定容于250mL的量瓶中，置于棕色瓶中保存。

2.2 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品0.024 8g，用蒸餾水溶解并定容至1 000mL的量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.024 8mg·mL－1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 未酸解樣品（供試品I） 取粉碎后的青龍衣5g，精密稱定，用80mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇超聲提取3次，每次20min，合并提取液，過濾，減壓濃縮，再用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇定容至100mL的量瓶中，作為供試品溶液I。

2.3.2 酸解樣品（供試品II） 取青龍衣粉末1g，精密稱定，用16mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇超聲提取3次，每次20min，過濾，合并濾液，用50mL 5mol·L－1的鹽酸100℃酸解2h，離心（轉(zhuǎn)速4 000r·min－1，離心15min），取上清液，用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇定容至100mL的量瓶中，作為供試品溶液II。

2.4 確定最大吸收波長 分別移取1.0mL對照品溶液、供試品溶液I、供試品溶液II和去離子水，加入1.5mL福林試劑及10mL的去離子水，用70g·L－1的碳酸鈉溶液定容至25mL，常溫靜置反應(yīng)1.5h后，用紫外可見分光光度計(jì)在400～800nm波長范圍內(nèi)掃描，其中對照品溶液的最大吸收波長為766nm、供試品溶液I的最大吸收波長為765nm、供試品溶液II的最大吸收波長為764nm。確定最大吸收波長為766±2nm。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別移取質(zhì)量濃度為0.024 8 mg·mL－1的沒食子酸對照品溶液1.0，1.2，2.0，3.0，4.0和5.0mL，加入1.5mL福林試劑后，加去離子水10mL，用70g·L－1碳酸鈉溶液定容至25mL，30℃反應(yīng)1.5h后，在766nm波長下測定吸光度值。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝151.8 X＋0.041，r＝0.999（n＝6）。結(jié)果表明，線性關(guān)系良好。

2.6 供試品溶液II制備條件的優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表，以總單寧含量為指標(biāo)，因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 酸水解的因素水平表Tab.1 Factor and level of orthogonal design

表2 酸水解的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of L9（34）orthogonal design

采用極差分析法，確定最佳的酸解工藝為：50倍量的4mol·L－1的鹽酸，在100℃下水解2h。

2.7 顯色條件的考察

2.7.1 碳酸鈉質(zhì)量濃度的考察 精密移取供試品溶液I和供試品溶液II各5份，每份1mL，按2.4項(xiàng)的方法操作，分別設(shè)置20，45，70，95和120g·L－1的碳酸鈉溶液，在766nm處測定吸光度值，供試品溶液I結(jié)果依次為0.280，0.387，0.408，0.392和0.413。供試品溶液II結(jié)果依次為0.159，0.373，0.378，0.365和0.343。由此可得，在20～70g·L－1的范圍內(nèi)，吸光度值隨碳酸鈉質(zhì)量濃度的增大而增加，質(zhì)量濃度在70～120g·L－1范圍內(nèi)，吸光度值隨碳酸鈉質(zhì)量濃度的增大而減小，而在碳酸鈉質(zhì)量濃度為120g·L－1時(shí)供試品溶液出現(xiàn)渾濁，故選擇最佳碳酸鈉質(zhì)量濃度為70g·L－1。

此顯色條件同時(shí)適用于供試品I和II。

2.7.2 福林試劑用量的考察 精密移取供試品溶液I和供試品溶液II各5份，每份1mL，按2.4項(xiàng)的方法操作，分別加入福林試劑0.5，1.0，1.5，2.0和2.5mL，在766nm處測定吸光度值，供試品溶液I的結(jié)果依次為0.299，0.381，0.491，0.421和0.433。供試品溶液II的結(jié)果依次為0.333，0.370，0.383，0.362和0.362。由此可知，最佳福林試劑用量為1.5mL。

此顯色條件同時(shí)適用于供試品I和供試品II。

2.7.3 顯色溫度的考察 精密移取供試品溶液I和供試品溶液II各5份，每份1mL，按2.4項(xiàng)的方法操作，分別在20，30，40，50和60℃下加熱，在766nm處測定吸光度值，供試品溶液I的結(jié)果依次為0.403，0.415，0.371，0.406和0.336。供試品溶液II的結(jié)果依次為0.357，0.379，0.363，0.365和0.345。由此可知，最佳的顯色溫度為30℃。

此顯色條件同時(shí)適用于供試品I和供試品II。

2.7.4 顯色時(shí)間的考察 精密移取供試品溶液I和供試品溶液II各5份，每份1mL，按2.4項(xiàng)的方法操作，分別顯色0.5，1，1.5，2和2.5h，在766nm波長下測定吸光度值，供試品溶液I的結(jié)果依次為0.463，0.476，0.493，0.485和0.482。供試品溶液II的結(jié)果依次為0.346，0.362，0.376，0.343和0.340。由此可知，最佳的顯色時(shí)間為1.5h。

此顯色條件同時(shí)適用于供試品I和供試品II。

2.8 方法學(xué)考察

2.8.1 精密度 移取質(zhì)量濃度為0.024 8mg·mL－1的沒食子酸對照品溶液2mL，按2.4項(xiàng)的方法操作，連續(xù)6次在766nm下測定吸光度值。結(jié)果依次為0.335，0.336，0.336，0.336，0.337和0.337，RSD為0.22%，表明該儀器精密度良好。

2.8.2 樣品穩(wěn)定性 分別移取供試品溶液I和供試品溶液II各1mL，室溫下分別放置0，0.5，1，2，3和4h后，按2.4項(xiàng)的方法操作，在766nm波長下測定吸光度值。供試品溶液I的結(jié)果依次為0.489，0.492，0.492，0.492，0.495和0.497，RSD為0.57%；供試品溶液II的結(jié)果依次為0.593，0.594，0.597，0.597，0.602和0.602，RSD為0.64%，表明供試品I和供試品II在4h內(nèi)的穩(wěn)定性均良好。

2.8.3 重復(fù)性的考察 分別按供試品溶液I和供試品溶液II制備，按2.4項(xiàng)的方法操作，于766nm波長處測定其吸光度，計(jì)算供試品溶液I中單寧的平均含量為1.292mg·g－1，RSD為2.9%。供試品溶液II中單寧的平均含量為8.682mg·g－1，RSD為1.2%。

2.8.4 加樣回收率 取青龍衣粉末6份，每份約2.5g，再向每份青龍衣粉末中加入約3mg沒食子酸對照品，精密稱定，按供試品溶液I制備樣品、2.4項(xiàng)的方法操作，在766nm下測定吸光度值。平均加樣回收率為99.87%，RSD為2.8%。結(jié)果見表3。

表3 供試品溶液I的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for sample I

取青龍衣粉末6份，每份約0.5g，再向每份青龍衣粉末中加入約4mg沒食子酸對照品，精密稱定，按供試品溶液II制備，按2.4項(xiàng)的方法操作，在766nm處測定吸光度值。平均加樣回收率為99.56%，RSD為1.6%。結(jié)果見表4。

表4 供試品溶液II的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests for sample II

由此一系列的方法學(xué)考察結(jié)果得出：此種改良的單寧顯色方法具有可靠性與普遍適用性。

2.9 樣品測定 分別按供試品溶液I和供試品溶液II制備，按2.4項(xiàng)的方法操作，于766nm波長處測定其吸光度，計(jì)算供試品溶液中水解單寧的含量。供試品溶液I中水解單寧的含量為1.272mg·g－1，供試品溶液II中水解單寧的含量為9.850mg·g－1。

3 討論

3.1 對此多酚顯色條件的普遍適用性討論 不同制備方法下的供試品溶液對Folin－Ciocalteu法測定青龍衣水解單寧類成分含量測定的最佳條件沒有影響，該實(shí)驗(yàn)方法同時(shí)適用于醇提單寧類成分和醇提酸解后的單寧類成分，對水解單寧類成分的含量測定具有普遍適用性。

3.2 多酚含量測定顯色條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)選顯色方法時(shí)采用低質(zhì)量濃度的碳酸鈉溶液（因?yàn)橘|(zhì)量濃度增高，造成供試樣品渾濁）并采用碳酸鈉溶液定容的方法?！吨袊幍洹肥珍浟薋olin－Ciocalteu比色法測定單寧類成分的方法，但是其采用福林試劑測定時(shí)，確定碳酸鈉的質(zhì)量濃度為290g·L－1，而在作者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，明顯觀察到此條件下供試樣品有明顯的渾濁現(xiàn)象產(chǎn)生，因此采用改良的Folin－Ciocalteu比色法測定。此外，作者還對碳酸鈉的用量進(jìn)行了考察，但是結(jié)果顯示，其用量的差別對青龍衣水解單寧的含量影響不大。

3.3 酸解工藝考察 在進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)考察供試品酸水解條件前，作者進(jìn)行了單因素考察，但是結(jié)果顯示，單因素變量對青龍衣水解單寧類成分含量的影響不大。

3.4 對實(shí)驗(yàn)研究對象的探討 與核桃青皮不同，本實(shí)驗(yàn)研究對象為核桃屬植物核桃（Juglans regia L.）未成熟果實(shí)的干燥果皮青龍衣。經(jīng)干燥后，本品易于儲存，與青皮相比，化學(xué)成分尤其是單寧類成分的組成與含量有所不同，并且青龍衣單寧的含量與保存年限有關(guān)，隨著保存年限的增加，單寧的含量有所降低。

3.5 樣品的制備方法對單寧含量的影響 由本實(shí)驗(yàn)供試品I和II的含量測定結(jié)果顯示，水解單寧含量測定影響因素很多。以沒食子酸為對照品，酸解后樣品單寧的含量大約為未酸解樣品的8倍，筆者認(rèn)為是酸解使供試品中水解單寧酸水解后釋放出更多的游離酚羥基，使其與福林試劑的絡(luò)合度更高，吸光度值增大，從而含量測定值高于未酸解供試品中水解單寧的含量測定值。

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Determination methods of hydrolysable tannins fromJuglans regia L.

JIANG Rui，ZHANG Xia，XING Dan，LIU Zizhen，LIU Weirui，YANG Yue，WANG Xiaohong，SHE Gaimei＊（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To establish a method for the determination of the hydrolyzed tannins fromJuglans regia L..Methods Gallic acid as a reference compound.UVspectrophotometry was used for the determination of the hydrolyzed tannins fromJuglans regia L..The modified Folin－Ciocalteu method was set up，then it was used to determine the contents of both the un－h(huán)ydrolyzed tannins and the hydrolyzed tannins.Results The standard curve equation was：Y＝151.8 X＋0.041，and gallic acid was linear in the range of 0.992－4.960μg·mL－1，r＝0.999（n＝6）.The optimal conditions for determining the hydrolyzed tannins fromJuglans regia L.were as followed：1.0mL of the sample，1.5mL of F－C reagent，10mL of water，with 70g·L－1sodium carbonate solution to the volume，treatment at 30℃for 1.5h.Conclusion This method is simple，accurate，stable and repeatable.It has universal applicability for the determination of both the un－h(huán)ydrolyzed tannins and the hydrolyzed tannins.

Juglans regia L.；tannins；hydrolyse；UVspectrophotometry

7,ebook=20

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.005

R282

A

1004－2407（2015）01－0016－05

2014－07－17）

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題（編號：2014－JYBZZXS－119和2013－JYBZZ－JS－137）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃（編號：201210026042）；北京市共建項(xiàng)目（編號：BJGJ1326）

姜蕊，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：折改梅，女，博士，副教授，博士生導(dǎo)師