桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量測(cè)定

銀慧慧 劉 偉 姜源明 孟 菲 覃振華 郭善康 趙 武 孫建華

廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所袁廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室袁廣西南寧530001

桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量測(cè)定

銀慧慧 劉 偉 姜源明 孟 菲 覃振華 郭善康 趙 武 孫建華

廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所袁廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室袁廣西南寧530001

目的測(cè)定桃金娘根中沒食子酸和總多酚的含量。方法沒食子酸的含量測(cè)定采用超高效液相色譜法。色譜條件院以甲醇-0.5%磷酸(15︰85)為流動(dòng)相袁采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器(PDA)檢測(cè)袁檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm袁流速為0.2 mL/min?？偠喾拥暮繙y(cè)定采用分光光度法袁以沒食子酸為對(duì)照品袁福林酚試劑為顯色劑袁在748 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果沒食子酸在3.853~115.6滋g/mL(r=0.9999)濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系袁回收率為98.73%~100.76%?？偠喾臃治龅木€性范圍為1.0~7.0滋g/m L(r=0.9995)袁回收率為98.04%~101.17%。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便堯快速堯重現(xiàn)性好袁可用于桃金娘根的質(zhì)量控制及定量分析。

桃金娘根；沒食子酸；總多酚；超高效液相色譜法；分光光度法

桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa(Ait.)Hassk]是一種優(yōu)良的野生植物資源袁尤盛產(chǎn)于中國(guó)和日本的南部等地區(qū)[1-2]曰桃金娘根(Radix Rhodomyrti)為桃金娘的干燥根袁含有黃酮苷?qǐng)蚧ㄉ盏赛S酮類成分以及植物多糖成分和沒食子酸等化合物多種活性成分[3-5]袁以野通經(jīng)活血堯收斂止血冶功效收載于葉獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品堯中藥卷)第一冊(cè)曳中[6]。沒食子酸是可水解鞣質(zhì)的組成部分[7-8]袁具有抗感染堯抗突變堯抗氧化等多種生物學(xué)活性[9-10]。

桃金娘根藥材及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)首次收載于農(nóng)業(yè)部葉獸藥規(guī)范曳1992版二部[11]袁并未收入以后各版葉中國(guó)獸藥典曳袁該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一直沿用至今[12]。該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)比較簡(jiǎn)單袁專屬性不強(qiáng)袁也不夠全面袁未對(duì)其所含特征性生物活性成分進(jìn)行色譜法鑒別袁也未建立科學(xué)堯準(zhǔn)確堯靈敏的光譜袁色譜及質(zhì)譜等方法對(duì)特征化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定。因此袁測(cè)定桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)袁為深入研究其藥物作用機(jī)制具有重要意義。本文采用超高效液相色譜法[13-15]和分光光度法分別測(cè)定桃金娘根中沒食子酸和總多酚的含量袁方法簡(jiǎn)單快捷袁重現(xiàn)性好袁可作為桃金娘沒食子酸堯桃金娘多酚等特征性化學(xué)成分定性鑒別或定量檢測(cè)的一種方法袁從而完善桃金娘中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)袁加強(qiáng)桃金娘根藥材或飲片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相色譜帶二級(jí)管陣列檢測(cè)器(photo-diode-array袁PDA)袁EmpowerTM3色譜工作站袁配BEH C18色譜柱(2.1 mm伊100 mm袁1.7滋m)(美國(guó)Waters公司)曰UV2550紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)曰SK7200HP型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo))曰Milli-Q超純水儀(Millipore公司)曰SQP型(精度0.01 mg)電子天平(德國(guó)Sartorious公司)曰CAP225D型(精度0.1mg)電子天平(德國(guó)Sartorious公司)。

1.2 試劑

甲醇(色譜純?cè)绹?guó)Tedia公司)袁0.2滋m混合濾膜(美國(guó)Waters公司)曰沒食子酸對(duì)照品(逸98%袁北京恒元啟天化工技術(shù)研究院堯北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制)曰福林酚試劑(0.5 mol/L袁上海荔達(dá)生物科技有限公司)曰磷酸(分析純?cè)瑥V東光華科技股份有限公司)曰桃金娘根藥材院玉林1堯2堯3號(hào)(產(chǎn)地廣西玉林袁經(jīng)廣西植物研究所溫放副研究員鑒定)曰水為超純水。

圖1 沒食子酸對(duì)照品和桃金娘根供試品的超高效液相色譜圖

表1 桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量(mg/g袁n=3)

2 方法與結(jié)果

2.1 沒食子酸測(cè)定

2.1.1 色譜條件色譜柱院WatersBEHC18色譜柱(2.1mm伊100 mm袁1.7滋m)曰流動(dòng)相院甲醇-0.5%磷酸(15頤85)曰流速院0.2mL/min曰檢測(cè)波長(zhǎng)院215 nm曰進(jìn)樣量院1滋L[16]。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取沒食子酸對(duì)照品適量袁精密稱定袁置棕色容量瓶中袁加甲醇制成濃度為115.6滋g/m L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液袁放4益冰箱備用。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將沒食子酸對(duì)照品溶液按不同倍數(shù)稀釋袁按野2.1.1冶項(xiàng)下條件對(duì)不同濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行色譜分析測(cè)定袁以沒食子酸峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸分析袁得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)為院Y=21040X+4663.4袁r=0.9999(n=6)。結(jié)果表明袁沒食子酸在3.853~115.6滋g/mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。對(duì)57.80滋g/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行平行測(cè)定(n=6)袁峰面積和峰高遷移時(shí)間的RSD分別為0.9%和1.1%。圖1A是沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的超高效液相色譜圖。

2.1.4 供試品溶液制備及沒食子酸含量的測(cè)定供試品溶液制備院桃金娘根藥材袁打粉袁過五號(hào)篩袁取0.3 g細(xì)粉袁精密稱定袁置于100 mL具塞錐形瓶中袁精密加入50mL甲醇袁稱定重量袁超聲(350W袁53 kHz袁30益)提取40min袁放冷袁再稱定重量袁用甲醇補(bǔ)足減失的重量袁搖勻袁過濾袁放4益冰箱備用。含量測(cè)定時(shí)過0.2滋m濾膜后供測(cè)試用。沒食子酸含量測(cè)定院在野2.1.1冶色譜條件下對(duì)供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)袁根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算沒食子酸含量。樣品分析色譜圖見圖1B袁桃金娘根中沒食子酸含量見表1。

2.1.5 精密度試驗(yàn)取桃金娘根藥材(玉林1號(hào))粉末0.3 g袁精密稱定袁按野2.1.4冶制備供試品溶液袁進(jìn)樣量為1滋L袁重復(fù)進(jìn)樣6次袁測(cè)定沒食子酸峰面積袁并計(jì)算沒食子酸含量袁測(cè)得沒食子酸含量的RSD為1.1%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取桃金娘根藥材(玉林1號(hào))粉末0.3 g袁精密稱定袁按野2.1.4冶制備供試品溶液袁在室溫下保存袁分別于0堯1堯2堯4堯6堯8堯24堯36堯48 h測(cè)定沒食子酸的峰面積袁測(cè)得沒食子酸含量的RSD為0.8%袁表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 回收率試驗(yàn)精密稱取已知沒食子酸含量的桃金娘根樣品(玉林1號(hào))9份袁分別向每份添加一定濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液袁每個(gè)濃度制備三份平行樣品袁測(cè)定其回收率袁結(jié)果見表2。

2.2 總多酚含量分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法采用紫外-分光光度法對(duì)桃金娘根中總多酚進(jìn)行檢測(cè)[17]。精密吸取待測(cè)樣品溶液100滋L于10mL容量瓶中袁加入3mL超純水袁搖勻袁再加入0.5mL福林酚試劑袁充分搖勻。1 min后再加入2.5 m L 20% Na2CO3溶液袁用超純水定容至刻度袁混勻。25益下避光反應(yīng)90 min后袁以顯色劑為空白袁在748 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A(沒食子酸對(duì)照品和桃金娘根供試品吸收光譜圖見圖2)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線袁計(jì)算出桃金娘根總多酚的含量。

表2 桃金娘根沒食子酸回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

圖2 沒食子酸對(duì)照品和桃金娘根供試品的吸收光譜圖

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取沒食子酸對(duì)照品適量袁精密稱定袁置棕色容量瓶中袁用超純水溶解袁配制成濃度為98.8滋g/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別精密吸取對(duì)照品溶液0堯0.1堯0.3堯0.5堯0.7mL置于10mL棕色容量瓶中袁按野2.2.1冶項(xiàng)進(jìn)行顯色和測(cè)定袁以吸光度A為縱坐標(biāo)袁濃度C為橫坐標(biāo)袁進(jìn)行回歸分析得到線性回歸方程院A=0.0953C+0.0738袁r=0.9995(n= 6)。結(jié)果表明袁沒食子酸含量在1.0~7.0滋g/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.2.3 供試品的配制和含量分析供試品溶液制備院桃金娘根藥材袁打粉袁過五號(hào)篩袁取0.3 g細(xì)粉袁精密稱定袁置于100mL具塞錐形瓶中袁精密加入50mL甲醇袁稱定重量袁超聲(350W袁53 kHz袁30益)提取40 min袁放冷袁再稱定重量袁用甲醇補(bǔ)足減失的重量袁搖勻袁過濾袁放4益冰箱備用。含量分析院同野2.2.1冶試驗(yàn)方法項(xiàng)下進(jìn)行顯色和測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總多酚含量袁桃金娘根中總多酚含量見表1。

2.2.4 精密度試驗(yàn)取桃金娘根樣品(玉林1號(hào))按上述樣品溶液配制方法及測(cè)定方法袁測(cè)定吸光度值袁重復(fù)測(cè)定6次袁RSD為0.87%。表明該比色法具有較高的精密度袁重復(fù)性好袁可以滿足桃金娘根中總多酚分析的要求。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)評(píng)價(jià)該比色法在一段時(shí)間內(nèi)的穩(wěn)定性袁取桃金娘根樣品(玉林1號(hào))按上述樣品溶液處理方法及測(cè)定方法袁待比色體系完全反應(yīng)后袁在25益下繼續(xù)放置30堯60堯90堯120堯150min袁然后測(cè)定吸光度值袁隨著時(shí)間的延長(zhǎng)袁其值有下降趨勢(shì)袁但幅度不大袁RSD為1.0%。

2.2.6 回收率試驗(yàn)精密稱取已知總多酚含量的桃金娘根樣品(玉林1號(hào))9份袁分別向每份添加一定濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液袁每個(gè)濃度制備三份平行樣品袁按野2.2.1冶方法顯色和含量測(cè)定袁計(jì)算回收率袁結(jié)果見表3。

表3 桃金娘根總多酚回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

桃金娘是中國(guó)南方地區(qū)民間傳統(tǒng)習(xí)用中草藥袁味甘堯澀堯平袁具有清熱解毒堯收斂止瀉堯理氣止痛堯祛風(fēng)活絡(luò)堯祛瘀止血堯安胎功效袁常用于急堯慢性腸胃炎袁消化不良袁痢疾袁腹瀉袁嘔吐泄瀉袁脘腹疼痛等臨床病癥。隨著桃金娘化學(xué)成分研究不斷深入和綜合開發(fā)力度不斷加大袁桃金娘化學(xué)成分及生物活性研究取得廣泛的研究成果曰鞣酸及多酚類是桃金娘中藥材主要有效化學(xué)成分之一袁具有收斂堯止瀉袁抗菌堯抗病毒堯抗腫瘤和抗氧化等生物活性[12]。

采用超高效液相色譜法檢測(cè)桃金娘根中沒食子酸含量。對(duì)供試品溶液色譜圖中沒食子酸色譜峰進(jìn)行純度檢查袁并與光譜庫進(jìn)行匹配袁結(jié)果顯示袁色譜峰純度角小于純度閾值袁表明供試品溶液中1.927min處的峰為單一峰曰匹配角度小于匹配閾值袁表明供試品溶液中相應(yīng)色譜峰的光譜與沒食子酸光譜庫的光譜非常相似袁可認(rèn)為是同一物質(zhì)。測(cè)得玉林桃金娘根藥材中沒食子酸含量分別為1.73堯1.48堯1.65 mg/g。采用福林酚試劑法和紫外-分光光度法測(cè)定桃金娘根中總多酚袁含量分別為79.21堯67.19堯74.33 mg/g。資料表明袁本試驗(yàn)是對(duì)桃金娘沒食子酸堯總多酚進(jìn)行的首次定量分析研究。

中藥材及飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是保證中藥材及飲片質(zhì)量袁體現(xiàn)中藥行業(yè)管理技術(shù)水平先進(jìn)程度的重要標(biāo)志曰制訂與國(guó)際醫(yī)藥行業(yè)接軌的中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是促進(jìn)中藥材走向國(guó)際市場(chǎng)堯?qū)崿F(xiàn)中藥材現(xiàn)代化的有效途徑。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)桃金娘沒食子酸超高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)和總多酚含量紫外-分光光度檢測(cè)技術(shù)袁方法科學(xué)堯靈敏度高堯快速堯重復(fù)性好袁可作為桃金娘沒食子酸堯桃金娘多酚等特征性化學(xué)成分定性鑒別或定量檢測(cè)的一種方法袁從而完善桃金娘中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)袁加強(qiáng)桃金娘根藥材或飲片的質(zhì)量控制。同時(shí)袁隨著桃金娘化學(xué)成分和生物活性研究的不斷深入袁匯集化學(xué)成分-藥效-藥理研究成果袁研究更能全面反映桃金娘藥材內(nèi)核本質(zhì)的色譜或光譜指紋圖譜袁對(duì)桃金娘中藥材種植堯采制堯流通規(guī)范化和質(zhì)量管理的科學(xué)化及深入開發(fā)桃金娘新制劑均有深遠(yuǎn)意義。

[1]Saising J袁Ongsakul M袁Voravuthikunchai SP.Rhodomyrtus tomentosa(Aiton.)Hassk ethanol extract and rhodomyr鄄tone院a potential strategy for the treatment of biofilm-form鄄ing staphylococci[J].JMed Microbiol袁2011袁60(12)院1793-1800.

[2]Lai TN袁Andr佴C袁Rogez H袁et al.Nutritional composition and antioxidant properties of the sim fruit(Rhodomyrtus tomentos a)[J].Food Chem袁2015袁168院410-416.

[3]黃景健袁陳海燕袁駱夏袁等.桃金娘莖枝中沒食子酸的分離鑒定及含量測(cè)定[J].中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師袁2012袁9(8)院14-17.

[4]Hiranrat A袁Chitbankluoi W袁Mahabusarakam W袁et al.A new flavellagic acid derivative and phloroglucinol from Rhodomyrtus tomentosa[J].Nat Prod Res袁2012袁26(20)院1904-1909.

[5]孫慧琳袁毛安偉袁劉珍珍袁等.桃金娘果多糖的抗氧化性研究[J].新中醫(yī)袁2012袁44(4)院127-129.

[6]中國(guó)獸藥典委員會(huì)編寫組.獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(化學(xué)藥品堯中藥卷)[M].一冊(cè).北京院中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社袁2013院230-231.

[7]Sarjit A袁Wang Y袁Dykes GA.Antimicrobial activity of gal鄄lic acid against thermophilic Campylobacter isstrain specif鄄ic and associated with a loss of calciumions[J].Food Mi鄄crobiol袁2015袁46院227-233.

[8]Xie M袁Hu B袁Wang Y袁et al.Grafting of gallic acid onto chitosan enhances antioxidant activities and alters rheo鄄logical properties of the copolymer[J].JAgric Food Chem袁2014袁62(37)院9128-9136.

[9]Patil SG袁Jadhav VM袁Kadam VJ.Development and valida鄄tion of UV spectrometric method for simultaneous estima鄄tion of gallic acid and piperine in herbal formulation[J]. World JPharm Pharm Sci袁2014袁3(12)院948-956.

[10]曲文娟袁張渭潔袁徐敏瑤袁等.高效液相色譜測(cè)定石榴皮水提取物中4種多酚化合物的含量[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)袁2011袁30(12)院1425-1429.

[11]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥規(guī)范[M].二部.北京院中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社袁1994.

[12]劉偉袁趙武袁孟菲袁等.桃金娘化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)袁2014袁41(3)院241-244.

[13]Baker PR袁Armando AM袁Campbell JL袁etal.Three-dimen鄄sional enhanced lipidomics analysis combining UPLC袁differential ion mobility spectrometry袁and mass spectro鄄metric separation strategies[J].JLipid Res袁2014袁55(11)院2432-2442.

[14]Vorkas PA袁Isaac G袁Anwar MA袁et al.Untargeted UPLCMS profiling pipeline to expand tissue metabolome cov鄄erage院application to cardiovascular disease[J].Anal Chem袁2015袁87(8)院4184-4193.

[15]Klimczak I袁Gliszczy俳ska-Swiglo A.Comparison of UPLC and HPLC methods for determination of vitamin C[J]. Food Chem袁2015袁175院100-105.

[16]張德全袁馬阿麗袁楊永壽袁等.HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地滇牡丹中沒食子酸和丹皮酚含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志袁2014袁20(5)院57-60.

[17]朱霞袁李煥榮袁羅游.Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定核桃青皮中多酚含量條件的優(yōu)化[J].食品與機(jī)械袁2014袁30(4)院122-125.

Determ ination of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodom yrti

YIN Huihui LIUWei JIANG Yuanming MENG Fei QIN Zhenhua GUO Shankang ZHAOWu SUN Jianhua
Veterinary Institute of the Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccine and New Technology,Guangxi,Nanning 530001,China

Objective To determine the content of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodomyrti.Methods Gal鄄lic acid in Radix Rhodomyrtiwas determined by ultra performance liquid chromatography(UPLC)with photo-diode-ar鄄ray(PDA)at215 nm,and themobile phasewasmethol-0.5%phosphateacid solustion(15頤85)ata flow rate of 0.2mL/min. The content of total polyphenolwas analyzed by spectrophotometry at 748 nm,gallic acid was selected as the reference substance.The colour-developing agentwas Folin-Ciocalteu憶s phenol reagent.Results The linear range for gallic acid and total polyphenol was 3.853-115.6滋g/mL(r=0.9999)and 1.0-7.0滋g/mL(r=0.9995)respectively.The recovery rate of gallic acid was 98.73%-100.76%and recovery rate of total polyphenol was 98.04%-101.17%.Conclusion The method is simple,rapid and good reproducible,can be used for quality control and quantitative analysis of Radix Rhodomyrti.

Radix Rhodomyrti;Gallic acid;Total polyphenol;UPLC;Spectrophotometry

R965

A[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]1673-7210（2015）06（c）-0096-04

院2015-03-20本文編輯院李亞聰)

廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)性研究課題(13-051-27-A-6)。

銀慧慧(1983.09-)袁女袁碩士袁從事藥物分析研究。

孫建華(1959.10-)袁男袁研究員袁主要從事生物制藥堯獸藥及天然藥物研究。