顯色基質法檢測乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素

曾云勝 張玲莉 彭 燕

1.湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院藥劑科袁湖北仙桃433000曰2.武漢大學人民醫(yī)院藥學部袁湖北武漢430060

顯色基質法檢測乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素

曾云勝1張玲莉2彭 燕2

1.湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院藥劑科袁湖北仙桃433000曰2.武漢大學人民醫(yī)院藥學部袁湖北武漢430060

目的比較顯色基質法與凝膠法檢測乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素的效果。方法采用樣品稀釋法研究顯色基質鱟試劑對不同批號乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的干擾袁并與凝膠法鱟試劑對樣品的干擾試驗比較。結果顯色基質法標準曲線的線性相關系數(shù)逸0.98袁乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液在0.5 mg/mL濃度時無干擾作用袁明顯高于凝膠法無干擾濃度(0.125 mg/mL)。結論與凝膠法比較袁顯色基質法有靈敏堯快速堯能定量堯重復性好的特點袁可用于乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液內毒素含量的測定。

顯色基質鱟試劑法；凝膠法；細菌內毒素；干擾試驗；乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液

注射用乳酸環(huán)丙沙星具有廣譜抗菌作用袁是較早應用于臨床的喹諾酮類藥物袁尤其對需氧革蘭陰性桿菌引起的感染有效袁由于其價格低廉袁療效明確袁因此在臨床上被廣泛應用。2010年版葉中國藥典曳規(guī)定乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液熱原檢測采用家兔法[1]袁國家藥典委員會于2012年8月3日已經公布的葉關于注射用乳酸環(huán)丙沙星的國家標準草案的公示曳袁其中規(guī)定了野細菌內毒素檢查冶袁用0.06 EU/mL或更高靈敏度的鱟試劑凝膠法檢查(葉中國藥典曳2010版二部附錄欲E[1])袁每毫克環(huán)丙沙星中含內毒素的量應小于0.50 EU。在凝膠法檢查基礎上袁筆者依顯色基質法規(guī)定袁通過試驗進行乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液中顯色基質法檢查的方法學研究袁以期為環(huán)丙沙星檢測內毒素尋求較為合適的方法。

細菌內毒素檢查法是檢測供試品中細菌內毒素的限量的方法袁主要方法分為凝膠法和光度測定法袁后者包含濁度法和顯色基質法。法定標準規(guī)定越來越多的注射制劑采用此法控制藥品中熱原的含量。近年來袁藥典委員會要求各地藥檢部門做了很多工作袁研究細菌內毒素檢測方法的合理性和可靠性。筆者對乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素檢測進行方法學研究袁建立了顯色基質法檢測該藥中細菌內毒素方法袁相比凝膠法袁更快速準確。

1 儀器與試劑

1.1 顯色基質鱟試劑盒

顯色基質鱟試劑(批號院120603)1.7 m L袁顯色基質(批號院120605)1.7mL袁偶氮化試劑一(批號院120628) 10 mL袁偶氮化試劑二(批號院120629)10 mL袁偶氮化試劑三(批號院120630)10mL袁HCl反應終止劑(批號院120623)50 mL。由廈門市鱟試劑試驗廠有限公司生產。

1.2 凝膠法鱟試劑

鱟試劑(靈敏度0.25 EU/mL袁廈門市鱟試劑試驗廠有限公司袁批號院130917)曰鱟試劑(靈敏度0.03EU/mL袁廈門市鱟試劑試驗廠有限公司袁批號院030511)曰鱟試劑(靈敏度0.03 EU/mL袁湛江安度斯生物有限公司袁批號院1301161)。

1.3 其他試劑

細菌內毒素標準品(CSE)(100 EU/支袁中國藥品生物制品檢定所袁批號院150608-201298)曰細菌內毒素檢測用水(BET水)(廈門市鱟試劑試驗廠有限公司袁批號院130428)50 mL。

1.4 樣品

乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液(商品名院西普樂袁拜耳制藥有限公司袁100 mL頤0.2 g頤0.9 g)3批(批號院BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6)。

1.5 其他材料

紫外可見分光光度計UV-2450(日本島津儀器公司)袁除熱原吸頭(200堯1000滋L)袁玻璃比色杯(0.5 cm)袁渦旋混合儀Vortex-Genie 2(美國Scientific Indus鄄tries)袁電熱恒溫水浴鍋TZL-5003(蘇州珀西瓦爾試驗設備有限公司)袁定量可調移液器(上海求精玻璃儀器廠袁100耀1000滋L袁20耀200滋L)盛冰水托盤袁試管架。

2 方法與結果

2.1 確定供試品內毒素限值

細菌內毒素限值L=K/M袁其中K表示人每千克體質量每小時最大可接受的細菌內毒素劑量袁藥典規(guī)定一般注射劑為5 EU/(kg窯h)袁M表示人每千克體質量每小時的最大供試品劑量[1]。乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液說明書規(guī)定成人1 h靜注最大劑量600mg袁人均體質量按60 kg估算袁則M=10 mg/(kg窯h)。計算得出本品的細菌內毒素限值L=0.5 EU/mg袁環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的濃度為2mg/mL袁限值即為L=1 EU/mL。

2.2 可靠性試驗

顯色基質法標準曲線的繪制院取細菌內毒素標準品(CSE)1支袁加入1 m L BET水復溶袁旋渦震蕩混合15 min袁即得100 EU/mL細菌內毒素溶液袁然后取0.1mL細菌內毒素溶液袁加入BET水0.9mL袁渦旋震蕩30 s袁稀釋為10 EU/mL袁再繼續(xù)用BET水將其稀釋至1 EU/mL細菌內毒素母液袁備用。取相應量鱟試劑堯顯色基質堯偶氮化試劑二堯偶氮化試劑三分別用BET水溶解袁偶氮化試劑一用HCl反應終止劑溶解袁震蕩10 s袁備用。取2mL空安瓿15支袁分別加入細菌內毒素檢查用水(1.0堯0.8堯0.6堯0.4堯0.2mL)和1 EU/mL的細菌內毒素母液(0堯0.2堯0.4堯0.6堯0.8 mL)制成系列細菌內毒素標準溶液(分別含有細菌內毒素0堯0.2堯0.4堯0.6堯0.8 EU/mL)。取標準溶液0.1 mL分別加入反應試管中(冰浴袁預先加有0.1mL鱟試劑的除熱原玻璃試管10 mm伊75 mm)袁震蕩10 s后袁置于37益水浴箱中孵育10 min袁取出試管曰加入顯色基質0.1 mL(冰浴)袁再置入37益水浴箱孵育6 min袁取出試管曰迅速加入偶氮試劑一(冰浴)堯偶氮試劑二堯偶氮試劑三各0.5 mL。靜置5min后袁檢測樣品反應液在545 nm處的吸光度袁用空白對照管校正。平均吸光度測定值依次為0.03堯0.153堯0.311堯0.456堯0.641。平均吸光度對內毒素濃度作線性回歸袁得標準曲線Y=0.7256X+0.1878 (r=0.9972)袁r逸0.98袁試驗有效。

2.3 顯色基質法的樣品干擾試驗

將批號為BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6的乳酸環(huán)丙沙星注射液樣品袁即濃度為2.0 mg/mL的樣品溶液袁成倍稀釋4個稀釋級(1頤2堯1頤4堯1頤8堯1頤16樣品稀釋液袁即濃度為1.0堯0.5堯0.25堯0.125mg/mL的樣品溶液袁稱為NPC溶液)袁分別用4個不同稀釋級供試品溶液加入1 EU/mL內毒素標準品溶液袁配制濃度為0.5 EU/mL內毒素樣品系列溶液(稱為PPC溶液)曰分別測量不同濃度PPC系列和NPC系列樣品在545 nm處的吸光度袁然后依據(jù)內毒素標準曲線方程計算樣品中內毒素濃度。加入內毒素標準溶液的供試品溶液內毒素濃度(Cs)和未加內毒素標準溶液的供試品溶液內毒素濃度(Ct)袁通過公式計算不同稀釋倍數(shù)溶液的內毒素回收率(R)院R=(Cs原Ct)/0.5伊100%。表1結果顯示袁樣品稀釋至1頤4堯1頤8堯1頤16倍后對鱟試劑顯色沒有干擾作用袁細菌內毒素回收率都在50%耀100%。樣品原液和1頤2倍樣品稀釋溶液有一定抑制干擾作用袁細菌內毒素顯色作用被抑制袁回收率不足50%袁表明樣品稀釋至0.5 mg/mL可以消除樣品對顯色鱟試劑的干擾。

2.4 凝膠法的樣品干擾試驗

2.4.1 干擾試驗相關樣品濃度的計算凝膠法鱟試劑的靈敏度一般在0.03耀0.50 EU/mL袁在確定乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細菌內毒素限值為1 EU/mL后袁可求得樣品的最小非干擾質量濃度不能低于原液17倍稀釋濃度袁即0.117 mg/mL。

2.4.2 乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液干擾預試驗取靈敏度姿為0.25 EU/mL的鱟試劑做預試驗袁將供試品(批號院BXGG4D7)分別稀釋至1.0堯0.5堯0.25堯0.125堯0.0625 mg/mL后進行干擾試驗袁同時配制兩份一系列同樣濃度的樣品溶液袁分別在其中加入內毒素袁使每一濃度的樣品溶液中含有2姿(0.5 EU/mL)和0.25姿(0.0625 EU/mL)的細菌內毒素袁此系列溶液被稱為供試品陽性對照液袁試驗取細菌內毒素標準溶液和細菌內毒素檢查用水分別做陽性對照液堯陰性對照液袁每個樣品平行操作2管。表2可見乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液(在0.125 mg/mL或更低質量濃度時)不會抑制干擾鱟試劑凝集。

表1 顯色基質法的樣品細菌內毒素干擾試驗結果

表2 凝膠法乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的干擾預試驗結果

2.4.3 供試品的干擾試驗分別取廈門鱟試劑試驗廠有限公司和湛江安度斯生物有限公司兩個不同廠家生產的靈敏度為0.03 EU/mL(批號分別為1301161堯130511)的鱟試劑袁對3批(BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6)0.125mg/mL的乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液進行細菌內毒素檢查的干擾試驗袁計算細菌內毒素檢查用水和乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液稀釋樣測定的反應終點濃度幾何平均值Es和Et袁當Et在0.5耀2.0時袁認為乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液在該濃度下不干擾鱟試劑試驗袁每管平行操作4份袁陰性對照設2個平行管。表3顯示袁乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液在稀釋至0.125mg/mL時袁其測定Et與細菌內毒素檢查用水的Es相比均在0.5耀2.0袁且Es與鱟試劑靈敏度(0.5耀2.0)姿一致袁樣品稀釋液對細菌內毒素檢查無干擾作用。

表3 凝膠法供試品的干擾試驗結果

2.5 樣品的測定

2.5.1 顯色基質法樣品測定選擇樣品(原濃度2.0mg/mL)加入BET水袁制得稀釋液1頤4(稀釋后濃度0.5mg/mL)作為供試品溶液檢查各批樣品內毒素含量。取供試品0.1 mL按野2.2冶項操作袁測定供試品內毒素含量袁結果BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6三批樣品定量檢測結果表明內毒素含量均小于0.01 EU/mL袁符合規(guī)定限度1 EU/mL以下。

2.5.2 凝膠法樣品測定取乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液稀釋至0.125mg/mL作為供試品溶液袁用靈敏度姿= 0.03 EU/mL凝膠鱟試劑檢查袁結果BXGG4D7堯BXGG4F1堯BXGG4C6三批樣品結果均呈陰性袁即小于1 EU/mL袁符合規(guī)定。

3 討論

顯色基質法相對凝膠法有抗干擾能力增強的優(yōu)點。文獻表明[2]袁凝膠法稀釋倍數(shù)為16倍袁略低于最大稀釋倍數(shù)17倍曰在檢測時鱟試劑只能選取最小靈敏度(0.03 EU/mL)進行試驗袁增加試驗耗材成本曰最大不干擾試驗濃度0.125 mg/mL袁略大于最小稀釋樣品濃度0.117 mg/m L袁因此檢測時袁稀釋過程較多袁容易引入試驗誤差曰終點顯色基質法與凝膠法相比袁不僅抗干擾濃度提高至0.5 mg/m L袁具有較好的抗干擾能力袁減少試驗操作多次稀釋帶來的誤差袁而且能定量測定樣品中的細菌內毒素含量袁因此該試驗方法更準確堯科學。選用顯色基質定量鱟試劑方法測定乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液具有優(yōu)勢。

顯色基質法相對其他定量方法的優(yōu)點是試驗條件相對低廉袁易于開展。根據(jù)2010年版葉中國藥典曳附錄[1]袁細菌內毒素含量定量方法有多種[3-10]袁與其他細菌內毒素含量測定方法相比袁終點顯色基質法的檢測方法是在供試品和鱟試劑及顯色基質之間的顯色反應被HCl終止后袁通過可見分光光度計檢測反應溶液在特定波長處吸光度來定量袁試驗設備條件要求不高袁并且具有很好的重復性和可操作性。

干擾試驗的常用方法和結果袁顯色基質法考察的關鍵因素是樣品的干擾試驗[11-14]。用供試品溶液配制樣品陽性溶液袁只有在樣品干擾試驗中袁細菌內毒素檢測回收率達到要求范圍袁試驗結果方為有效。排除樣品溶液對鱟試劑的干擾方法包含樣品稀釋法和其他一些適宜的方法袁如色氨酸難溶于水袁需要加熱至80益袁再稀釋后才能檢測內毒素袁而門冬氨酸和谷氨酸不僅需要稀釋袁還需要加入NaOH溶液調節(jié)pH至7.0后才能消除對試驗的干擾[15]。干擾試驗證明袁采用0.5mg/mL乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液稀釋液作內毒素含量檢查溶液袁回收率符合要求。

顯色基質法比凝膠法有定量和抗干擾強的優(yōu)勢袁但目前顯色基質法并沒有得到較好的推廣應用袁主要有兩個方面因素院淤顯色基質鱟試劑試驗操作過程略顯繁瑣[16]袁不僅鱟試劑反應后孵育袁而且增加顯色基質加入樣品孵育過程袁最后另加入偶氮試劑顯色袁比較耗費試驗時間曰于定量鱟試劑價格相比凝膠法沒有競爭力袁以檢測15個樣品為例袁凝膠法平均每單個樣本需要耗材約為定量顯色鱟試劑的一半。相信隨著顯色基質鱟試劑生產工藝的改進袁其成本會進一步降低袁將被廣泛應用。

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Bacterial endotoxin test of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection by chromogenic substrate limulus amebocytelysate

ZENG Yunsheng1ZHANG Lingli2PENG Yan2
1.Department of Pharmacy,the First People憶s Hospital of Xiantao City,Hubei Province,Xiantao 433000,China; 2.Department of Pharmacy,People憶s Hospital ofWuhan University,Hubei Province,Wuhan 430060,China

Ob jective To compare bacterial endotoxin test of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection by chromogenic substrate limulus amebocytelysatemethod and sol-gelmethod.M ethods Sample dilutionmethod was used to study of chromogenic substrate limulus reagent on different batches of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection,compared with interfering test of sol-gel limulus reagent sample.Results The standard curve correlation co鄄efficient of chromogenic substrate limulus amebocytelysate was above 0.98.Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection was not interferewith the concentration of 0.5mg/mL,which was obviously higher than that ofgel coltmethod (0.125 mg/mL).Conclusion Compared with sol-gelmethod,chromogenic substratemethod has the characteristic of sen鄄sitive,rapid,quantitative and good repeatability,can be used for content determination on endotoxin of Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloride Injection.

Chromogenic substrate limulus amebocytelysate method;Sol-gelmethod;Bacterial endotoxin;Interfering test;Ciprofloxacin Lactate and Sodium Chloricle Injection

R965

A[文獻標識碼]1673-7210（2015）06（c）-0092-04

院2014-02-09本文編輯院李亞聰)

湖北省自然科學基金項目(2013CFB239)。

曾云勝(1968.10-)袁男袁湖北仙桃人曰研究方向院醫(yī)院藥學曰主要成果院仙桃市科技進步一等獎一項。

彭燕(1976.3-)袁女袁湖北人袁碩士曰研究方向院臨床藥學和醫(yī)院藥學曰主要成果院湖北省科技進步三等獎兩項袁湖北省科技進步二等獎一項袁武漢市科技進步三等獎一項袁武漢市科技進步二等獎一項。