食管鱗狀細(xì)胞癌組織中ADAMTS18基因的表達(dá)及臨床意義

郭麗麗 郭勝利 郭煒 董稚明 郭艷麗

1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邯鄲056001；2.河北省邯鄲市邯鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邯鄲056001；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北石家莊050011

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中ADAMTS18基因的表達(dá)及臨床意義

郭麗麗1郭勝利2郭煒3董稚明3郭艷麗3

1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邯鄲056001；2.河北省邯鄲市邯鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北邯鄲056001；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室，河北石家莊050011

目的通過(guò)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）組織中含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶18（ADAMTS18）mRNA及蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)，探討ADAMTS18在ESCC發(fā)生、發(fā)展中所起的作用及臨床意義，為ESCC的臨床早期診斷及預(yù)后評(píng)估提供新的客觀參考指標(biāo)。方法采用半定量-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的方法及免疫組化S-P的方法（生物素-鏈霉卵白素過(guò)氧化酶系統(tǒng)）對(duì)72例ESCC組織及癌旁正常組織中ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果①ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.361±0.115），在癌旁正常組織中表達(dá)量為（0.879±0.265），ESCC組織中ADAMTS18 mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織（P＜0.01）；ADAMTS18 mRNA在高/中分化鱗癌組中的相對(duì)表達(dá)量為（0.496±0.153），在低分化鱗癌組中為（0.232±0.088），低分化鱗癌組ADAMTS18 mRNA表達(dá)量顯著低于高/中分化鱗癌組（P＜0.05）。②ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為34.7%（25/72），在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為93.1%（67/72），ADAMTS18蛋白在ESCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織（P＜0.01）；ADAMTS18蛋白在高/中分化鱗癌組中的陽(yáng)性表達(dá)率為45.4%（20/44），在低分化鱗癌組中為17.8%（5/28），低分化鱗癌組ADAMTS18蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于高/中分化鱗癌組（P＜0.05）。結(jié)論ADAMTS18基因在ESCC中的異常表達(dá)與ESCC的發(fā)生、發(fā)展及組織分化程度關(guān)系密切，檢測(cè)ESCC組織中ADAMTS18基因的表達(dá)情況，有助于ESCC早期診斷及預(yù)后評(píng)估。

食管鱗狀細(xì)胞癌；ADAMTS18；表達(dá)

食管癌（esophageal carcinoma，EC）屬于上消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)食管癌人數(shù)約40萬(wàn)例，死亡約30萬(wàn)例，其中我國(guó)食管癌發(fā)病率和病死率在全球位居首位［1］。目前迫切需要對(duì)食管癌發(fā)病原因及機(jī)制進(jìn)行深入研究，從而尋求敏感、特異的早期診斷指標(biāo)和治療方法。含凝血酶敏感素基序的去整合素金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs，ADAMTS）家族的蛋白水解功能可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲有關(guān)。該家族不同成員在不同來(lái)源腫瘤的發(fā)生中所起的作用也不盡相同。國(guó)內(nèi)外對(duì)ADAMTS18基因的表達(dá)與食管癌的關(guān)系罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）組織及癌旁正常組織中ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，探討ADAMTS18與ESCC發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性及其生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源組織標(biāo)本均來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2008～2011年的ESCC手術(shù)患者，共72例，其中，男53例，女19例，年齡43～76歲，平均（61.2±2.5）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，入選患者均簽署了知情同意書。按照1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期（Ⅰ期2例，Ⅱ期38例，Ⅲ期29例，Ⅳ期3例）；根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（45例）和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（27例）；按腫瘤組織分化程度分為高分化組（17例）、中分化組（27例）、低分化組（28例）。所有患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療，術(shù)中取癌旁正常黏膜組織以及ESCC原發(fā)灶組織。所有入選患者均通過(guò)胃鏡檢查診斷為食管癌，且術(shù)后病理檢查確診為ESCC，保存完整臨床病理資料及手術(shù)記錄。術(shù)中切取標(biāo)本時(shí)，遵循先取癌旁組織、后取腫瘤組織的原則，切除標(biāo)本一部分用于提取RNA，一部分用于制作蠟塊（HE染色及免疫組化染色）。

1.1.2 主要試劑TRIzol（美國(guó)SBS公司）、總RNA提取試劑（美國(guó)Promega公司）、逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒（美國(guó)Foments公司）、綠色體系（美國(guó)Promega公司）、DNA Marker（北京Solarbio科學(xué)技術(shù)有限公司）、氯仿、異丙醇（上?；瘜W(xué)試劑總廠）、瓊脂糖（西班牙進(jìn)口分裝）、DEPC（美國(guó)Invitrogen公司）、EB（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、兔抗人ADAMTS18多克隆抗體（生工生物工程有限公司）、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）、EDTA修復(fù)液（Gene Tech公司）、DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR法檢測(cè)ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的表達(dá)按照TRIzol試劑說(shuō)明書低溫提取ESCC組織及癌旁組織中RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。ADAMTS18上游引物為5'-TGCACAACGGCAGGAAAAAG-3'，下游引物為5'-TCAAAATCGCCGAGGGCTTA-3'；GAPDH作為內(nèi)參，上游引物為5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，下游引物為5'-GTGGTCGTTGAGGGCAAT-3'。RT-PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，72℃7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，ADAMTS18的PCR產(chǎn)物片段大小為114 bp，GAPDH為342 bp。采用Gel Pro Analysizer 3.1軟件測(cè)定ADAMTS18基因灰度值，每個(gè)細(xì)胞及組織標(biāo)本均重復(fù)做3次取平均值，以內(nèi)參照GAPDH的OD值標(biāo)化ADAMTS18基因的OD值，從而得到相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.2 免疫組織化學(xué)S-P法（生物素-鏈霉卵白素過(guò)氧化酶系統(tǒng)）檢測(cè)ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的表達(dá)石蠟標(biāo)本常規(guī)4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的切片經(jīng)脫蠟、水化后，采用3%甲醇過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，EDTA緩沖液高壓鍋抗原熱修復(fù)。一抗為兔抗人ADAMTS18多克隆抗體，加SP試劑后DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知平滑肌纖維組織陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)半定量標(biāo)準(zhǔn)：物鏡下陽(yáng)性細(xì)胞≤10%判為1分；＞10%～50%判為2分；＞50%～75%判為3分；＞75%判為4分。染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)判斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)色判為0分；淡黃色判為1分；棕黃色判為2分；棕褐色判為3分。將上述兩項(xiàng)得分相加：0分表示為“-”，1～2分表示為“+”，3～4分表示為“++”，5～6分表示為“+++”。以“++”或“+++”時(shí)定義為陽(yáng)性表達(dá)，以“-”或“+”時(shí)定義為陰性表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果經(jīng)兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)師采用雙盲法診斷，一張切片需觀察至少5個(gè)高倍視野。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)

ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中的相對(duì)表達(dá)量為（0.361±0.115），在癌旁正常組織中為（0.879±0.265），ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)量顯著低于相應(yīng)癌旁正常組織，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。分組分析發(fā)現(xiàn)，低分化鱗癌組ADAMTS18 mRNA表達(dá)量顯著低于高/中分化鱗癌組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ADAMTS18 mRNA的表達(dá)與ESCC患者的年齡、性別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中ADAMTS18 mRNA表達(dá)

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征與ADAMTS18 mRNA表達(dá)的關(guān)系

表1 食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征與ADAMTS18 mRNA表達(dá)的關(guān)系

項(xiàng)目例數(shù)ADAMTS18 mRNAP值年齡（歲）＜50≥50性別0.599 17 55 0.368±0.111 0.370±0.101 0.431男女53 19 0.373±0.106 0.380±0.100淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.848無(wú)有27 45 0.372±0.114 0.351±0.110 TNM分期Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳ組織分化高/中分化低分化0.580 40 32 0.378±0.112 0.349±0.103 0.016 44 28 0.496±0.153 0.232±0.088

2.2 ESCC組織中ADAMTS18蛋白的表達(dá)

ADAMTS18蛋白的陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)，染色均勻呈棕黃色（圖2，見(jiàn)封四）。72例癌旁組織中ADA MTS18蛋白陽(yáng)性表達(dá)67例，陽(yáng)性表達(dá)率為93.1%（67/72），72例ESCC組織中ADAMTS18蛋白陽(yáng)性表達(dá)25例，陽(yáng)性表達(dá)率為34.7%（25/72），ADAMTS18蛋白在ESCC組織中的表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于癌旁組織，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩者差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。分組分析發(fā)現(xiàn)，低分化鱗癌組ADAMTS18蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于高/中分化鱗癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ADAMTS18蛋白表達(dá)與ESCC患者的年齡、性別、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征與ADAMTS18蛋白表達(dá)的關(guān)系［n（%）］

3 討論

食管癌是常見(jiàn)的上消化道惡性腫瘤，全球統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率的第8位，病死率在惡性腫瘤病死率排名中位居第4位［1］。在世界范圍內(nèi)中國(guó)是食管癌發(fā)病率及病死率最高的國(guó)家。中國(guó)人群食管癌以ESCC為高發(fā)類型，占90%以上，以40歲以上男性較多見(jiàn)。自20世紀(jì)中葉至今，我國(guó)在ESCC手術(shù)切除率和患者5年生存率等諸多方面取得了矚目的成就，但ESCC患者中50%已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤(rùn)或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，術(shù)后2年約半數(shù)患者仍然死于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，其預(yù)后差，遠(yuǎn)期生存率極低，晚期ESCC的5年生存率約為15%［2］，早期ESCC的5年生存率高于90%［3］。因此，ESCC患者重在疾病的早期診斷，對(duì)參與ESCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中較特異的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行研究，能夠?yàn)镋SCC的早期診斷提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，有效降低ESCC的病死率。

腫瘤相關(guān)基因發(fā)生突變或表達(dá)異常，致使機(jī)體發(fā)生惡性腫瘤，且能夠從原發(fā)腫瘤部位脫離并穿透基底膜，進(jìn)一步侵襲結(jié)締組織，使惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至鄰近組織或者遠(yuǎn)處器官，這一系列復(fù)雜過(guò)程需要借助細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-細(xì)胞間質(zhì)間的相互作用才能完成。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力取決于其誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜能力的大小，ECM和基底膜表面存在多種受體，與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，腫瘤細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)宿主基質(zhì)細(xì)胞大量分泌金屬蛋白酶類，并協(xié)同為腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利的腫瘤微環(huán)境。其中，ADAMTS家族在腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。ADAMTS也稱Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的去整合素金屬蛋白酶，屬于Zn2+依賴-分泌型金屬蛋白酶超家族，包含19個(gè)基因家族成員，由平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，屬于可溶性分泌蛋白酶，其中金屬蛋白酶域以及Ⅰ型凝血酶敏感蛋白（thrombospondin typeⅠ，TSP1）基序?yàn)槠錁?biāo)志性結(jié)構(gòu)，TSP1基序能夠介導(dǎo)ADAMTS結(jié)合ECM蛋白并與之發(fā)生作用［4］。據(jù)報(bào)道，ADAMTS家族成員在正常的胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、性腺發(fā)育、卵巢正常生理過(guò)程、炎癥發(fā)生以及結(jié)締組織病、血栓性血小板減少性紫癜、血栓形成、惡性腫瘤等人體正?；虍惓５纳砘顒?dòng)中都扮演著重要的角色［5-10］。

ADAMTS18屬于全基因組關(guān)聯(lián)基因，位于人類染色體16q23，含有13個(gè)外顯子，可以編碼一個(gè)含有1222個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)［11］。關(guān)于ADAMTS18與ESCC的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR及免疫組化技術(shù)檢測(cè)了72例ESCC黏膜組織及其相應(yīng)癌旁正常黏膜組織中的ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ESCC組織中ADAMTS18 mRNA的表達(dá)量及ADAMTS18蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著低于癌旁正常黏膜組織。推測(cè)ADAMTS18在ESCC組織中屬于抑癌基因，它的異常表達(dá)導(dǎo)致ESCC的發(fā)生，目前國(guó)外文獻(xiàn)［11-12］也有結(jié)果一致的報(bào)道，但對(duì)于ADAMTS18是如何發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用的機(jī)制還不甚明確。ADAMTS18可能直接作用于其他抑制因子，從而起到間接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；也可能通過(guò)裂解血小板聚合物實(shí)現(xiàn)，血小板裂解產(chǎn)物能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生血管反應(yīng)，逐漸使癌變組織細(xì)胞修復(fù)至正常組織細(xì)胞狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)患者的臨床病理特征進(jìn)行分組分析，ADAMTS18 mRNA及蛋白的表達(dá)可能與組織分化程度關(guān)系緊密，高/中分化ESCC組ADAMTS18 mRNA相對(duì)表達(dá)量以及ADAMTS18蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于低分化ESCC組，隨著ESCC組織分化程度逐漸下降，ADAMTS18基因的表達(dá)也隨之下調(diào)。有文獻(xiàn)證實(shí)，人類黑素瘤中存在著ADAMTS18基因的大規(guī)模突變及異常表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)中ADAMTS18的基因突變能夠降低層粘連蛋白的黏附作用，從而促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［13］。本研究證實(shí)，ADAMTS18基因的低水平表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)ESCC的發(fā)生發(fā)展，其高水平表達(dá)可能會(huì)抑制ESCC的發(fā)生發(fā)展，屬于抑癌基因。

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。ADAMTS家族成員廣泛參與機(jī)體多種重要的生理性以及病理性活動(dòng)過(guò)程，例如細(xì)胞凋亡、血管新生、腫瘤發(fā)生發(fā)展等，因此對(duì)ADAMTS結(jié)構(gòu)、功能以及其與人類多種疾病關(guān)系的深入研究，能夠?yàn)榧膊〉脑缙谠\斷、后續(xù)治療、預(yù)后評(píng)估提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和廣闊的前景。關(guān)于ADAMTS18在ESCC組織中的異常表達(dá)對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展影響的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。

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Expression of ADAMTS18 in esophageal squamous cell carcinoma and its clinical significance

GUO Lili1GUO Shengli2GUO Wei3Dong Zhiming3GUO Yanli3
1.Clinical Laboratory,Handan Central Hospital,Hebei Province,Handan056001,China;2.Clinical Laboratory, Hangang Hospital,Hebei Province,Handan056001,China;3.Pathology Laboratory,Hebei Provincal Cancer Institute, the Fourth Hospital of Hebei Medical University,Hebei Province,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveThrough the detection of the ADAMTS18 mRNA and protein expression in esophagus squamous cell carcinoma(ESCC),to explore function and clinical significance of the ADAMTS18 in the ESCC,in order to gain objective reference index in the ESCC early diagnosis and prognostic evaluation.MethodsReverse transcriptase polymerase chain reaction method(RT-PCR)and immunohistochemistry method were used respectively to detect mRNA and protein expression of ADAMTS18 in 72 cases ESCC tumor tissues and corresponding normal tissues.Results①The expression of ADAMTS18 mRNA in ESCC tumor tissues was significantly lower than that in corresponding normal tissues［(0.361±0.115)vs(0.879±0.265)］(P＜0.01).The expression level of ADAMTS18 mRNA in the ESCC tumor tissues with high/moderate differentiation was significantly higher than that in the ESCC tumor tissues with low differentiation［(0.496±0.153)vs(0.232±0.088)］(P＜0.05).②The positive protein expression rate of ADAMTS18 in the ESCC tumor tissues(34.7%,25/72)was significantly lower than that in corresponding normal tissues(93.1%,67/72)(P＜0.01).The protein expression of ADAMTS18 in high/moderate differentiation group(45.4%,20/44)was significantly higher than that in low differentiation group(17.8%,5/28)(P＜0.05).ConclusionAberrant expression of ADAMTS18 is closely related to the development,occurrence and degree of differentiation of ESCC,detection of the ADAMTS18 mRNA and protein expression in ESCC will help to determine early diagnosis and prognosis assessment of ESCC.

Esophageal squamous cell carcinoma;A disintegrin and metalloproteasewiththrombospondin motifs 18;Expression

R735.102

A

1673-7210（2015）02（a）-0076-04

2014-10-15本文編輯：程銘）

郭麗麗，女，碩士研究生；研究方向：臨床生物化學(xué)。

郭煒，女，博士，教授；研究方向：病理學(xué)與病理生理學(xué)。