生長抑制因子5抑制肺癌細胞增殖作用的研究

張旭濤 孟瑾 張峰

1.第四軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，陜西西安710032；2.解放軍309醫(yī)院藥劑科，北京100091

生長抑制因子5抑制肺癌細胞增殖作用的研究

張旭濤1孟瑾2張峰1

1.第四軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，陜西西安710032；2.解放軍309醫(yī)院藥劑科，北京100091

目的探討生長抑制因子5（ING5）抑制肺癌細胞增殖的作用。方法采用慢病毒介導的基因轉染方法建立A549細胞ING5高表達細胞系A549-ING5-OE和A549細胞空質粒對照細胞系A549-control。采用細胞增殖實驗和克隆形成實驗觀察ING5過表達對肺癌A549細胞增殖能力的影響；采用皮下接種方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察ING5對裸鼠皮下成瘤能力及腫瘤體積大小的影響。結果本實驗成功構建了肺癌A549-ING5過表達細胞系，與A549-control比較，細胞系A549-ING5-OE中ING5表達顯著增高；增殖實驗結果顯示ING5高表達顯著抑制了肺癌細胞的增殖能力；克隆形成實驗結果顯示細胞系A549-ING5-OE中ING5高表達的肺癌細胞克隆形成能力明顯低于A549-control肺癌細胞（P＜0.01）；裸鼠在體水平研究結果顯示ING5高表達可以抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長。結論ING5可以抑制肺癌細胞的增殖，為臨床治療肺癌提供新的治療靶點。

肺癌細胞；生長抑制因子5；增殖；克隆形成；裸鼠成瘤

肺癌的發(fā)生是個涉及多基因改變的復雜過程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是兩大關鍵要素。生長抑制因子（inhibitor of growth，ING）作為候選抑癌基因家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要抑制作用［1］，目前已發(fā)現(xiàn)5個成員，包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5［2］。ING編碼的蛋白在結構上具有相似性，功能上存在共同的作用，ING蛋白參與磷脂酰肌醇介導的脂類信號通路及激素介導的通路，抑制細胞生長，誘導細胞凋亡和DNA損傷修復［3-7］，同時ING蛋白也具有各自的特點［8-13］。在多種腫瘤中ING家族基因的表達均下調(diào)［7］，已有的研究表明，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中ING1、ING2、ING4均起到重要作用［14-15］。ING5作為家族的最新成員于2003年被首次報道。2006年Cote課題組［16］研究揭示ING5參與構成兩種組蛋白乙?；D移酶（HAT）復合體，并且能與組蛋白結合而作為連接HAT與組蛋白的橋梁分子參與組蛋白修飾和染色質重構，表明ING5可通過輔助HAT表觀調(diào)控基因表達而發(fā)揮抑癌作用。ING5與臨床腫瘤發(fā)生的關系研究表明，61%的原發(fā)口腔腫瘤組織中ING5 mRNA水平降低，31例中有3例檢測到ING5基因發(fā)生突變；在肝癌組織中ING5 mRNA表達量下降，起到抑癌基因的作用［17］；在食管鱗癌組織中ING5 mRNA的表達量同樣下降［18］。進一步研究表明ING5可與P53相互作用，并促進P53轉錄活化，而引起結腸癌細胞周期阻滯和凋亡［19］。但ING5在肺癌中的作用尚未見報道，本實驗擬建立ING5高表達肺癌細胞株，采用細胞增殖、克隆形成及裸鼠皮下荷瘤模型探討ING5對肺癌細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞（中科院上海細胞庫），GV218載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司，蛋白定量試劑盒、SDSPAGE凝膠配制試劑盒、細胞裂解液均購自西安碧云天科技生物有限公司，蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche，G418購自美國Gibco，細胞培養(yǎng)液DMEM高糖、胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購自美國HyClone，青鏈霉素混合液購自北京Solarbio，ING5抗體購自美國Proteintech，ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Advansta，兔二抗購自英國Abcam，電子游標卡尺購自哈爾濱量具刃具有限責任公司，4%多聚甲醛購自西安科昊生物技術有限公司，裸鼠由第四軍醫(yī)大學（以下簡稱“我?！保嶒瀯游镏行奶峁?/p>

1.2 GV218慢病毒載體轉染構建A549-ING5-OE和A549-control細胞系

含ING5 cDNA的慢病毒載體和對照載體為吉凱公司構建。用胰蛋白酶消化液消化293T細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為6×105個/mL，接種于細胞培養(yǎng)皿，待細胞密度達80%時進行轉染。轉染前2 h將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液，將轉染復合物加入293T細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后棄掉含有轉染復合物的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞，加入10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后收集293T細胞上清液，1000 r/min離心除去細胞碎片，收集上清即為病毒顆粒濃縮液。對數(shù)生長期A549細胞，培養(yǎng)液中加入病毒顆粒濃縮液進行感染，12 h后觀察細胞狀態(tài)，沒有明顯的細胞毒副作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新的培養(yǎng)液，感染3 d后觀察GFP基因的的表達。感染后A549細胞計數(shù)，調(diào)整密度為300個/孔，接種至6孔板，用G418篩選，藥物濃度為5 μg/mL，每隔24 h更換新的培養(yǎng)液，篩選3 d后，用熒光顯微鏡觀察細胞克隆，挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)，直至獲得需要的細胞量。

1.3 Western blot檢測ING5在A549-control和A549-ING5-OE細胞中的表達

收集對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞在冰上裂解30 min，細胞裂解液為150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5%去氧膽酸、0.1%SDS、50 mmol/L Tris（pH 8.0），蛋白酶抑制劑（1∶25），裂解后高速離心20 min，收集上清即為細胞總蛋白，蛋白定量試劑盒定量。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制10%的凝膠。電泳，樣品在濃縮膠電壓100 V，20 min，在分離膠電壓120 V繼續(xù)電泳。轉膜，電壓55 V，210 min，轉膜結束后用麗春紅染液染色，PBST脫色。牛奶封閉1 h，一抗ING5（1∶1000）封閉4℃過夜。PBST洗3次，每次5 min，二抗封閉1 h，PBST洗3次，每次5 min。用增強化學發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（Amersham Bioscience）檢測蛋白的表達。

1.4 檢測ING5對肺癌細胞增殖的抑制

將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞用胰蛋白酶消化液消化，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×104個/孔，接種至24孔板，兩種細胞各種4個復孔，每孔加1 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。從細胞貼壁開始計時24、48、72、96 h后各計數(shù)1次。

1.5 檢測ING5對肺癌細胞克隆形成能力的抑制

將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞用胰蛋白酶消化液消化，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為300個/孔，接種至6孔板，每孔加2 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。細胞接種5 d后每孔各加500 μL胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁生長15 d后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結晶紫溶液染色15 min，PBS輕輕沖洗細胞，室溫風干后計數(shù)多于50個細胞的克隆。根據(jù)公式計算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/300×100%。

1.6 ING5抑制裸鼠皮下成瘤實驗

出生4周雄性裸鼠，對照組和實驗組各7只隨機分組，由第四軍醫(yī)大學（以下簡稱“我?！保嶒瀯游镏行拇B(yǎng)。裸鼠適應7 d后，將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞用胰蛋白酶消化液消化，計數(shù)，調(diào)整密度為每只裸鼠5×106個/200 μL，混勻在無血清DMEM培養(yǎng)液，分別接種至對照組和實驗組裸鼠皮下。7 d后裸鼠皮下成瘤，每隔3 d用電子游標卡尺測1次移植瘤長徑（a）和短徑（b），并計算腫瘤體積（V）：ab2/2，繪制腫瘤生長曲線。裸鼠實驗遵循我校關于動物保護和做好動物福利規(guī)定，并經(jīng)我校實驗動物倫理委員會批準。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot檢測ING5蛋白表達

為了檢測ING5是否在所轉染細胞中高表達，將A549-control和ING5高表達細胞對數(shù)生長期時用細胞裂解液提取總蛋白，Western blot結果顯示與A549-control相比，ING5在A549-ING5-OE細胞中表達量顯著增高。見圖1。

圖1 ING5在A549-ING5-OE細胞中的表達情況

2.2 ING5抑制肺癌細胞增殖

顯微鏡下觀察可見A549-control和A549-ING5-OE細胞生長良好，緊密排列，形態(tài)為梭形，細胞之間形成連接。A549-ING5-OE細胞的增殖速度明顯低于A549-control細胞，增殖速度為A549-control的一半，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 A549-control與A549-ING5-OE細胞增殖曲線

2.3 ING5抑制肺癌細胞克隆形成能力

A549-control和A549-ING5-OE細胞接種在6孔板15 d后，計數(shù)細胞數(shù)多于50個的克隆，結果表明與A549-control相比ING5高表達肺癌細胞的克隆形成能力明顯降低，A549-ING5-OE細胞的克隆形成率為A549-control細胞的50%，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖3。

2.4 ING5抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長

裸鼠皮下接種A549-control和A549-ING5-OE細胞，7 d后成瘤，隨著時間的增加，接種A549-control裸鼠腫瘤生長較快，接種A549-ING5-OE的裸鼠腫瘤生長明顯較慢，結果表明ING5高表達后顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長。見圖4。

圖3 A549-control與A549-ING5-OE克隆形成

圖4 生長抑制因子5抑制裸鼠皮下種植瘤的生長

2.5 接種A549-ING5-OE及A549-control細胞后大鼠體積變化情況

接種A549-ING5-OE細胞成瘤，腫瘤體積大小基本無增加。A549-control細胞接種成瘤，腫瘤體積明顯增大。從腫瘤生長曲線可以看出ING5高表達的肺癌細胞腫瘤生長明顯被抑制，腫瘤體積較對裸鼠A549-control細胞接種顯著減小。見圖5。

圖5 腫瘤生長曲線

3 討論

作為候選抑癌基因家族成員，近年來ING家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機制受到越來越多的關注。路美玲等［17］研究結果表明，與正常肝組織相比，肝癌細胞株ING5 mRNA表達明顯降低，在腫瘤轉化過程中與正常組織相比ING5表達明顯被抑制。趙春陽等［18］研究結果表明，在腫瘤細胞中ING5表達水平越低，腫瘤的惡性程度就越高。

研究表明，肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉移是多基因參與、多步驟發(fā)生的過程［19-20］。隨著近年來外科技術發(fā)展的日趨完善，新的化學治療藥物和局部治療方法不斷出現(xiàn)，但對肺癌的總體治療效果卻不甚理想，因此從分子水平研究肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機制，針對肺癌中異常分子的治療藥物和治療方法就成了新的研究熱點，并促進了肺癌分子靶向治療的出現(xiàn)。本研究中，通過慢病毒介導的基因轉染方法使ING5在A549細胞中高表達，發(fā)現(xiàn)ING5高表達后與對照肺癌細胞相比，其增殖能力和克隆形成能力均降低，說明在細胞水平ING5抑制了肺癌細胞的增殖和克隆形成能力。通過裸鼠在體水平的研究同樣發(fā)現(xiàn)，ING5抑制了裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長，動物實驗研究結果同樣說明ING5抑制了肺癌細胞的增殖，與上述細胞實驗結果相符。

綜上所述，ING5在肺癌細胞高表達后抑制了肺癌細胞的增殖，提示ING5在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到了抑癌基因的作用，為肺癌的基因治療提供了新的靶點。

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Study of the antiproliferative effects of inhibitor of growth 5 on lung cancer cells

ZHANG Xutao1MENG Jin2ZHANG Feng1
1.Department of Pharmacology,School of Pharmacy,the Fourth Military Medical University,Shaanxi Province,Xi'an 710032,China;2.Department of Pharmacy,the 309th Hospital of PLA,Beijing100091,China

ObjectiveTo study the antiproliferative effects of inhibitior of growth 5(ING5)on lung cancer A549 cells.MethodsING5 gene transfer was mediated by lentiviruses to establish ING5 over expression cell line A549-ING5-OE and the corresponding control cell line A549-control.Proliferation assay and colony formation assay were used to observe the effects of ING5 over-expression on the proliferation capacity of lung cancer cells.Mouse xenograft models were established with A549 ING5 over-expression cells and A549-control cells by subcutaneous injection.ResultsThe ING5 over-expression cell line A549-ING5-OE and A549-control cell line were established.ING5 over-expression inhibited proliferation and colony formation ability of A549 cells(P＜0.01).In vivo results showed ING5 over expression could suppress the ability of the tumorigenesis and tumor growth.ConclusionING5 over-expression can inhibit proliferation of lung cancer A549 cells,and provide a new therapeutic target for the clinical treatment of lung cancer.

Lung cancer cells;Inhibitor of growth 5;Proliferation;Colony formation;Nude mice xenografts

R734

A

1673-7210（2015）02（a）-0004-04

2014-11-14本文編輯：任念）

國家自然科學基金面上項目（編號31071189）。

張旭濤（1989.5-），男，陜西渭南人，第四軍醫(yī)大學藥學院2012級藥理學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：分子藥理學。

張峰（1970.12-），女，博士，副教授；研究方向：分子藥理學。