外周血單一核細(xì)胞的體外活化對成纖維細(xì)胞增殖和基質(zhì)金屬蛋白酶產(chǎn)生的影響

康玉英 孫彩虹 鞠梅 陳崑 顧恒

膠原是皮膚組織細(xì)胞外結(jié)構(gòu)中最豐富的成分，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是一組與膠原降解有關(guān)的酶，其中MMP-1、3、9這三種酶協(xié)同作用可完全降解皮膚膠原，被認(rèn)為與光老化關(guān)系最為密切［1-2］。紫外線可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)或分泌MMP［3］，而對皮膚組織中炎癥浸潤細(xì)胞在光老化中的作用研究較少，僅發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目在曝光部位增多［4-5］。為進(jìn)一步探討炎癥細(xì)胞是否直接或間接促進(jìn)MMP增高或活性增加，我們對被活化的外周血單一核細(xì)胞（PBMC）及其活化產(chǎn)物刺激培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行研究，探討炎癥細(xì)胞在光老化中的作用。

材料與方法

一、材料

1.標(biāo)本來源：原代人皮膚成纖維細(xì)胞取自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所兒童眼瞼手術(shù)后皮膚組織，PBMC取自3例健康志愿者。本研究獲中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家長及所有志愿者均簽署知情同意書。

2.主要試劑和儀器：鼠抗人MMP-1、MMP-3、MMP-9、白細(xì)胞介素（IL）-6 ELISA檢測試劑盒為武漢USCN LIFE公司產(chǎn)品，RNA抽提試劑TRIzol（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），DL 2000 DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物［寶生物工程（大連）有限公司］，植物血凝素（PHA）（上海伊華公司），兔抗人多克隆CD3抗體、CD28抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），噻唑藍(lán)（MTT）（美國Sigma公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。CO2孵箱（日本Espec公司），GeneAmp PCR System 2700（美國ABI公司），JS-380A自動凝膠圖像分析儀（上海培清科技有限公司），Transwell培養(yǎng)板（美國Costar公司），DG-3022A酶聯(lián)免疫檢測儀（南京華東電子集團(tuán)公司）。

二、方法

1.分離、活化 PBMC：參照文獻(xiàn)［6-7］，無菌條件下采集健康志愿者新鮮抗凝外周血10 ml，于4 h內(nèi)用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單一核細(xì)胞。接種至96孔培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞至2×106/ml，分3組加入不同活化劑，使淋巴細(xì)胞活化：對照組不加活化劑，PHA組用含100 mg/L PHA刺激，雙抗體組用含2 mg/L CD3及5mg/LCD28雙抗體刺激，每孔終體積200μl。于37℃、相對濕度95%、5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h，收集上清液。

2.MTT法檢測PBMC增殖活性：處理細(xì)胞、分組同上，每組設(shè)3個復(fù)孔，在培養(yǎng)（72 h）結(jié)束前4 h每孔加入MTT 20 μ（l5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入 150 μl二甲基亞砜（DMSO），低速振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀550 nm處測定各孔A值。

3.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測PBMC活化后上清液 IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋白含量：收集活化、培養(yǎng)72 h后PBMC的上清液，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、陰性對照孔（RPMI 1640培養(yǎng)基），按照ELISA試劑盒說明書操作，450 nm處測定各孔A值。運(yùn)用CurveExpert1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及擬合方程，計(jì)算待測樣品的含量。

4.半定量反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR法檢測PBMC活化后MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA的表達(dá)：同上處理細(xì)胞、分組，每組10孔，培養(yǎng)24 h，收集PBMC，根據(jù)Trizol試劑說明書操作，提取總RNA，以β肌動蛋白基因?yàn)閰⒄諛?biāo)準(zhǔn)，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）服務(wù)有限公司合成。引物序列：β肌動蛋白正向引物5′-CACCTTCTACAATGAGCTGC-3′，反向 5′-AGGC AGCTCGTAGCTCTTCT-3′，擴(kuò)增片段長度466 bp；MMP-1正向引物 5′-CTGAAGGTGATGAAGCAGC C-3′，反向 5′-AGTCCAAGAGAATGGCCGAG-3′，擴(kuò)增片段長度428 bp；MMP-3正向引物5′-CTCACAG ACCTGACTCGGTT-3′，反向 5′-C ACGCCTGAAGG AAGAGATG-3′，擴(kuò)增片段長度 294 bp；MMP-9 正向引物 5′-CGCAGACATCGTCATCCAGT-3′，反向 5′-GGATTGGCCTTGGAAGATGA-3′，擴(kuò)增片段長度406 bp。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)42℃15 min、95℃5 min、4℃5 min。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μl在15 g/L瓊脂糖凝膠中（含0.5 mg/L溴化乙錠）電泳，于自動凝膠圖像分析儀上掃描灰度值，以β肌動蛋白作內(nèi)參，計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平。每組樣本重復(fù)3次。

5.MTT法檢測不同稀釋度PBMC活化后上清液（即CM）對培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞增殖活性的影響：同前方法分離、活化PBMC并收集CM，-20℃保存?zhèn)溆?。參考文獻(xiàn)［8］分離、培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，取第3～10代對數(shù)生長期人皮膚成纖維細(xì)胞，按5×104/ml密度接種至 96孔板，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后（約10 h）分別加入不同體積的3組CM，分別為對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組，終體積為 200 μl，每組 CM 最終稀釋度分別為 1/2、1/5、1/10、1/20，同時設(shè)不加CM組（對照組），共13組，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT20μl，同方法2測定各孔A值。

6.ELISA法檢測不同稀釋度CM對成纖維細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白的影響：同方法5將成纖維細(xì)胞接種至96孔板，每孔100 μl，待細(xì)胞生長融合達(dá)90%時吸棄培養(yǎng)基，換用無血清DMEM培養(yǎng)基，過夜，吸棄培養(yǎng)基，加入無血清DMEM培養(yǎng)基及不同體積的3組CM，終體積為200 μl，CM最終稀釋度分別為1/2、1/5、1/10，同時設(shè)不加CM組（對照組），共10組，每組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48h，收集上清液，最后同3組原液CM一起檢測，共13組，同方法3用ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中 MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白含量。

7.半定量RT-PCR法檢測不同組CM對成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA的影響：同方法5將成纖維細(xì)胞接種至6孔板，每孔3 ml，待細(xì)胞生長融合達(dá)90%時吸棄培養(yǎng)基，換用無血清DMEM培養(yǎng)基，過夜，吸棄培養(yǎng)基，加入2.4 ml無血清DMEM培養(yǎng)基及600 μl不同CM原液，同時設(shè)對照組加入無血清DMEM培養(yǎng)基3 ml，培養(yǎng)24 h，吸棄上清液，各孔加入TRIzol 1 ml，反復(fù)吹打，使細(xì)胞完全融解，根據(jù)Trizol試劑說明書操作，提取總RNA，同方法4檢測成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 的相對表達(dá)水平。每組樣本重復(fù)3次。

結(jié) 果

一、不同處理組PBMC的增殖活性及CM中IL-6、MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋白含量比較

不同活化劑刺激PBMC后，PHA組、雙抗體組、對照組之間 PBMC 增殖活性（A550）（F=8.507，P＜0.05）及上清液中 IL-6（F=5.692，P＜ 0.05）、MMP-3含量（F=6.098，P＜0.05）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步兩兩比較，PHA組較對照組增殖活性及分泌IL-6、MMP-3水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。3組上清液中均未檢測到MMP-1、MMP-9蛋白（A值為0.00至0.09不等）。

二、不同處理組 PBMC MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表達(dá)

活化劑刺激PBMC后可表達(dá)MMP-1 mRNA，但不表達(dá)MMP-3 mRNA（圖1）或MMP-9 mRNA（圖中未標(biāo)出）。經(jīng)Games-Howell檢驗(yàn)兩兩比較，對照組、雙抗體組、PHA組間PBMC表達(dá)MMP-1 mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

三、不同稀釋度CM對成纖維細(xì)胞增殖活性的影響

單因素方差分析顯示，1/2、1/5、1/10、1/20 CM 刺激后對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組、對照組組間成纖維細(xì)胞增殖活性（A值）比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組各組內(nèi) 1/2、1/5、1/10、1/20 CM 刺激后細(xì)胞增殖活性比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表1 不同處理組PBMC增殖活性（A550值）、上清液中IL-6和MMP-3含量、MMP-1 mRNA的相對表達(dá)水平（±s）

表1 不同處理組PBMC增殖活性（A550值）、上清液中IL-6和MMP-3含量、MMP-1 mRNA的相對表達(dá)水平（±s）

注：n=3。a：與對照組比較，P ＜ 0.05；b：與雙抗體組比較，P ＜ 0.05。PBMC：外周血單一核細(xì)胞；IL：白細(xì)胞介素；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

組別 增殖活性 I L-6（μ g/L） M M P-3（m g/L） M M P-1 m R N A對照組 0.3 7 0±0.0 5 6 0.9 8 6±0.1 0 7 6.5 6 7±2.1 2 2 0.0 8 3±0.0 1 6雙抗體組 0.4 7 0±0.1 2 8 1.1 3 5±0.1 9 3 7.3 1 8±2.3 8 1 0.1 8 8±0.0 3 0 a植物血凝素組 0.6 5 0±0.0 4 4 a 1.5 7 3±0.3 8 4 a 1 2.6 7 0±2.4 8 5 a 0.7 1 4±0.1 0 4 ab

圖1 不同處理組外周血單一核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-1 mRNA 表達(dá)結(jié)果 1、4、7：MMP-3（294 bp）；2、5、8：MMP-1（428 bp）；3、6、9：β肌動蛋白（466 bp）。1～3：雙抗體刺激組；4～6：PHA刺激組；7～9：對照刺激組；10：陰性對照組；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物

表2 不同稀釋度條件培養(yǎng)基（CM）刺激后成纖維細(xì)胞增殖活性（A550值，±s）

表2 不同稀釋度條件培養(yǎng)基（CM）刺激后成纖維細(xì)胞增殖活性（A550值，±s）

注：n=3。同一稀釋度下不同組間及同一組內(nèi)不同稀釋度間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）

C M稀釋度組別F值 P值1/2 1/5 1/1 0 1/2 0對照組 0.2 7±0.0 2 5對照刺激組 0.2 7±0.0 3 6 0.2 8±0.0 1 2 0.2 6±0.0 1 0 0.2 5±0.0 1 5 0.7 3 0 ＞0.0 5雙抗體刺激組 0.2 9±0.0 5 0 0.2 4±0.0 5 3 0.2 5±0.0 3 2 0.2 6±0.0 5 1 0.6 9 5 ＞0.0 5 P H A刺激組 0.2 4±0.0 1 5 0.2 4±0.0 2 6 0.2 4±0.0 5 5 0.2 6±0.0 3 2 0.2 2 0 ＞0.0 5 F值 1.3 8 1 0.9 8 7 0.4 1 4 0.0 8 8 P值 ＞0.0 5 ＞0.0 5 ＞0.0 5 ＞0.0 5

四、不同稀釋度CM對成纖維細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9蛋白的影響

不同稀釋度CM刺激成纖維細(xì)胞后上清液中可檢測到MMP-3蛋白，以原液CM中含量最高，1/10CM刺激時最低；在相同的稀釋度刺激時，上清液中MMP-3含量以PHA刺激組最高，對照刺激組最低。經(jīng)單因素方差分析，原液CM及1/5、1/10 CM刺激后對照刺激組、雙抗體刺激組、PHA刺激組組間上清液中MMP-3含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），1/2 CM刺激后，3組間MMP-3含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；進(jìn)一步兩兩比較顯示，原液CM、1/10 CM時PHA刺激組較對照刺激組MMP-3水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），PHA刺激組與雙抗體刺激組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；1/5 CM時PHA刺激組較對照刺激組、雙抗體刺激組MMP-3水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；原液 CM、1/5 CM、1/10 CM時，對照刺激組與雙抗體刺激組比較，MMP-3含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。而未受CM刺激的成纖維細(xì)胞上清液中未檢測到MMP-3蛋白（A450值為0），不同稀釋度CM刺激及未受CM刺激的成纖維細(xì)胞上清液中未檢測到MMP-1或MMP-9蛋白（A450值為0.00至0.09不等）。

五、不同組CM對成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

對照組及不同刺激組成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNA均有表達(dá)（圖2），4組間比較MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表4。但各組均無MMP-9 mRNA表達(dá)。

表3 條件培養(yǎng)基（CM）原液以及不同稀釋度CM刺激成纖維細(xì)胞后上清液中MMP-3含量比較（mg/L，± s）

表3 條件培養(yǎng)基（CM）原液以及不同稀釋度CM刺激成纖維細(xì)胞后上清液中MMP-3含量比較（mg/L，± s）

注：n=3。a：與對照刺激組比較，P＜0.05；b：與雙抗體刺激組比較，P＜0.05。MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

組別 C M 1/2 C M 1/5 C M 1/1 0 C M對照刺激組 6.2 4±2.0 0 3.0 5±0.8 0 1.1 1±0.4 6 0.4 0±0.1 2雙抗體刺激組 6.7 9±1.9 8 4.0 7±1.8 9 1.2 8±0.3 6 0.6 0±0.0 0植物血凝素刺激組 1 2.1 2±2.6 2 a 8.7 8±3.7 6 2.5 6±0.1 7 ab 0.7 3±0.1 2 a F值 6.4 1 5 4.5 9 7 1 5.4 3 0 8.6 4 2 P值 ＜0.0 5 ＞0.0 5 ＜0.0 1 ＜0.0 5

圖2 不同處理組成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA 表達(dá)檢測結(jié)果 2、5、8、11：β 肌動蛋白（466 bp）；3、6、9、12：MMP-1（428 bp）；4、7、10、13：MMP-3（294 bp）。1：陰性對照；2 ～ 4：對照組；5～7：對照刺激組；8～10：植物血凝素（PHA）刺激組；11～13：雙抗體刺激組；M：標(biāo)準(zhǔn)參照物

表4 不同處理組成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA的相對表達(dá)水平（±s）

表4 不同處理組成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-1、MMP-3 mRNA的相對表達(dá)水平（±s）

注：n=3。4組成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）

組別 M M P-1 m R N A M M P-3 m R N A對照組 1.1 3 6±0.0 8 8 0.9 9 1±0.3 1 4對照刺激組 0.9 7 8±0.1 3 0 1.0 0 3±0.2 0 6雙抗體刺激組 0.9 4 7±0.2 6 4 0.8 8 8±0.1 2 7植物血凝素刺激組 1.2 3 1±0.2 2 3 0.9 6 3±0.0 8 4 F值 1.4 9 1 0.1 9 6 P值 ＞0.0 5 ＞0.0 5

討 論

近年來炎癥細(xì)胞在光老化中的作用逐漸受到研究者的關(guān)注。Bosset等［4］和 Hase 等［5］研究顯示，皮膚組織中肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)目在曝光部位增多，曝光部位皮膚MMP-1染色陽性的T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著增加。我們既往研究亦證實(shí)，曝光部位淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞數(shù)目顯著高于非曝光部位，且淋巴細(xì)胞數(shù)增加與光照射累積相關(guān)［9］。有關(guān)炎癥細(xì)胞在光老化中的作用機(jī)制以及對MMP影響的進(jìn)一步研究顯示，巨噬細(xì)胞可以分泌MMP-1［10］，肥大細(xì)胞能分泌激活MMP-1的蛋白酶［11］，T 淋巴細(xì)胞可表達(dá) MMP-2、MMP-9、MMP-10、MMP-13（膠原酶 3）［12-14］。這些研究直接或間接證明炎癥浸潤細(xì)胞可分泌或激活某些MMP，參與光老化過程。

經(jīng)典的PBMC活化劑包括PHA、刀豆素A等，為多克隆激活劑，不涉及抗原的特異性。而T淋巴細(xì)胞活化過程需要第一、二信號，涉及細(xì)胞表面抗原CD3、CD28的激活，近年以CD3、CD28抗體作為淋巴細(xì)胞激活劑的研究較多［15］。淋巴細(xì)胞活化后可分泌 IL-6、干擾素（IFN）-γ、腫瘤壞死因子（TNF）等［16］，而 IL-1α、IL-6 等可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-3［17-18］，考慮到 IL-6 作為淋巴細(xì)胞活化后產(chǎn)物可能參與誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌MMP，故將IL-6作為淋巴細(xì)胞活化的檢測指標(biāo)之一，但隨后的淋巴細(xì)胞活化后產(chǎn)物（包含IL-6）刺激成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)其顯著的刺激作用，所以IL-6對MMP的刺激作用未作深入研究。

本研究分別以非特異性活化劑PHA及特異性活化劑CD3、CD28雙抗體作為刺激劑，同時以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基作為對照，觀察PBMC活化情況。MTT法檢測PBMC增殖活性，發(fā)現(xiàn)PHA刺激組細(xì)胞活性最高，同時該組活化24 h后MMP-1 mRNA表達(dá)最高，活化后上清液中IL-6、MMP-3濃度亦最高，提示細(xì)胞增殖明顯者M(jìn)MP-1 mRNA表達(dá)水平及分泌IL-6、MMP-3水平高，而對照組細(xì)胞增殖活性、MMP-1 mRNA表達(dá)水平及分泌IL-6、MMP-3 水平最低，CD3、CD28 雙抗體刺激組上述檢測值介于二者之間，這與雷其洪等［19］對T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化的研究一致，即PHA刺激后細(xì)胞的增殖指數(shù)高于 CD3、CD28 抗體刺激者。Hase 等［5］發(fā)現(xiàn)，曝光部位皮膚MMP-1染色陽性的T淋巴細(xì)胞數(shù)顯著增加，在一定條件下培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞表達(dá)MMP-1 mRNA，與我們的結(jié)果一致。但是在活化后上清液中各組均未檢測到MMP-1蛋白，同樣在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上清液中亦未檢測到MMP-1蛋白，但可檢測到MMP-1 mRNA表達(dá)，可能為檢測方法不當(dāng)或靈敏度太低有關(guān)，確切原因有待進(jìn)一步研究。

同時，我們在PBMC CM中可以檢測到MMP-3蛋白，且濃度較高。采用不同稀釋度的CM刺激成纖維細(xì)胞后其上清液中MMP-3蛋白含量隨著CM的稀釋而減少，且均低于原液CM。同時RPMI 1640培養(yǎng)基及不加CM的成纖維細(xì)胞上清液中均未檢測到MMP-3蛋白，表明MMP-3為PBMC活化后產(chǎn)物，CM刺激成纖維細(xì)胞后上清液中MMP-3為CM中MMP-3稀釋而非成纖維細(xì)胞分泌所致，而且CM刺激成纖維細(xì)胞后各組MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)水平無顯著性差異，表明CM對成纖維細(xì)胞的MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)無影響，但不同刺激組PBMC活化后均未檢測到MMP-3 mRNA表達(dá)。Fisher等［20］報(bào)道，紫外線照射人皮膚后 MMP-8 蛋白水平升高并伴隨中性粒細(xì)胞浸潤，但MMP-8 mRNA無表達(dá)，用糖皮質(zhì)激素氯倍他索預(yù)處理可顯著阻斷該過程，表明紫外線照射使中性粒細(xì)胞脫顆粒釋放預(yù)先存在的MMP-8蛋白，從而使皮膚中MMP-8蛋白水平升高，而不是新合成MMP-8。本研究中PBMC活化后上清液中可檢測到MMP-3蛋白但無MMP-3 mRNA表達(dá)，是否與該研究中MMP-8升高的機(jī)理類似有待進(jìn)一步深入研究。

有報(bào)道顯示，對體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞加入細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-10 后上清液中 MMP-1、-3、-9 濃度均增加［21］，將急性心肌梗死患者的PBMC體外培養(yǎng)24 h后MMP-9 mRNA表達(dá)及蛋白水平均增加2倍［22］。而我們在PBMC活化后上清液及培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞上清液中均未檢測到MMP-9蛋白，且在不加及加入 CM 24、36、48、72 h后均未檢出，同時在MMP-9 mRNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)中對不同的PCR引物、退火溫度進(jìn)行了摸索，但MMP-9 mRNA表達(dá)均為陰性（因結(jié)果陰性未列出），是否為刺激條件、實(shí)驗(yàn)方法等不同導(dǎo)致MMP-9在培養(yǎng)的PBMC、成纖維細(xì)胞中表達(dá)陰性仍需進(jìn)一步研究。

本研究對PBMC進(jìn)行體外活化，可檢測到MMP-3蛋白及MMP-1 mRNA表達(dá)，但PBMC活化后上清液不能刺激成纖維細(xì)胞分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9 蛋 白 及 表 達(dá) MMP-1、MMP-3 mRNA，表明炎癥細(xì)胞可能通過自身產(chǎn)生MMP而不是作用于成纖維細(xì)胞發(fā)揮作用。我們的研究顯示，PBMC體外活化后可以表達(dá)MMP-1 mRNA及分泌MMP-3蛋白，下一步我們將使用紫外線照射PBMC，以觀察紫外線照射下PBMC的活化、MMP表達(dá)等情況，進(jìn)一步明確炎癥浸潤細(xì)胞在光老化中的作用以及分子機(jī)制。

［1］Fisher GJ,Datta SC,Talwar HS,et al.Molecular basis of suninduced premature skin ageing and retinoid antagonism［J］.Nature,1996,379（6563）:335-339.

［2］Fisher GJ,Wang ZQ,Datta SC,et al.Pathophysiology of premature skin aging induced by ultraviolet light［J］.N Engl J Med,1997,337（20）:1419-1428.

［3］Scharffetter K,Wlaschek M,Hogg A,et al.UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblastsin vitroandin vivo［J］.Arch Dermatol Res,1991,283（8）:506-511.

［4］Bosset S,Bonnet-Duquennoy M,Barré P,et al.Photoageing shows histological features of chronic skin inflammation without clinical and molecular abnormalities ［J］.Br J Dermatol,2003,149（4）:826-835.

［5］Hase T,Shinta K,Murase T,et al.Histological increase in inflammatory infiltrate in sun-exposed skin of female subjects:the possibleinvolvement of matrix metalloproteinase-1 produced by inflammatory infiltrate on collagen degradation ［J］.Br J Dermatol,2000,142（2）:267-273.

［6］徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) ［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:1214-1215.

［7］駱群,呂明,于鳴,等.抗CD28抗體協(xié)同刺激增強(qiáng)抗CD3抗體體外激活T淋巴細(xì)胞并降低TGF-β的表達(dá)［J］.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2006,14（3）:547-551.

［8］趙娟,石艷,孫波,等.人皮膚成纖維細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2008,34（5）:899-902.

［9］康玉英,鞠梅,陳旭,等.炎癥浸潤細(xì)胞在曝光和非曝光部位皮膚中的組織學(xué)表現(xiàn)［J］.中華皮膚科雜志,2011,44（7）:476-478.

［10］Welgus HG,Campbell EJ,Cury JD,et al.Neutral metalloproteinases produced by human mononuclear phagocytes.Enzyme profile,regulation,and expression during cellular development［J］.J Clin Invest,1990,86（5）:1496-1502.

［11］Suzuki K,Lees M,Newlands GF,et al.Activation of precursors for matrix metalloproteinases 1 （interstitial collagenase） and 3（stromelysin）by rat mast-cell proteinases I and II［J］.Biochem J,1995,305（Pt 1）:301-306.

［12］Romanic AM,Madri JA.The induction of 72-kD gelatinase in T cells upon adhesion to endothelial cells is VCAM-1 dependent［J］.J Cell Biol,1994,125（5）:1165-1178.

［13］Weeks BS,Schnaper HW,Handy M,et al.Human T lymphocytes synthesize the 92 kDa type IV collagenase （gelatinase B）［J］.J Cell Physiol,1993,157（3）:644-649.

［14］Willmroth F,Peter HH,Conca W.A matrix metalloproteinase gene expressed in human T lymphocytes is identical with collagenase 3 frombreastcarcinomas［J］.Immunobiology,1998,198（4）:375-384.

［15］Garlie NK,LeFever AV,Siebenlist RE,et al.T cells coactivated with immobilized anti-CD3 and anti-CD28 as potential immunotherapy for cancer［J］.J Immunother,1999,22（4）:336-345.

［16］ Mikko M,Fredriksson K,Wahlstr?m J,et al.Human T cells stimulate fibroblast-mediated degradation of extracellular matrixin vitro［J］.Clin Exp Immunol,2008,151（2）:317-325.

［17］Fagot D,Asselineau D,Bernerd F.Direct role of human dermal fibroblasts and indirect participation of epidermal keratinocytes in MMP-1 production after UV-B irradiation［J］.Arch Dermatol Res,2002,293（11）:576-583.

［18］夏濟(jì)平,宋秀祖,畢志剛.紫外線對皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP-1和MMP-3的影響［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2006,22（1）:11-13.

［19］雷其洪,吳健民.CD28單克隆抗體共刺激檢測T細(xì)胞功能［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2000,23（4）:226.

［20］Fisher GJ,Choi HC,Bata-Csorgo Z,et al.Ultraviolet irradiation increases matrix metalloproteinase-8 protein in human skinin vivo［J］.J Invest Dermatol,2001,117（2）:219-226.

［21］Wong WR,Kossodo S,Kochevar IE.Influence of cytokines on matrix metalloproteinases produced by fibroblasts cultured in monolayer andcollagen gels［J］.J Formos Med Assoc,2001,100（6）:377-382.

［22］Fang L,Du XJ,Gao XM,et al.Activation of peripheral blood mononuclear cells and extracellular matrix and inflammatory gene profile in acute myocardial infarction［J］.Clin Sci（Lond）,2010,119（4）:175-183.