梅毒螺旋體粘附于人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

吳凡 張瑞麗 張津萍 王千秋

近10年，我國(guó)梅毒發(fā)病率逐年升高，其中三期梅毒發(fā)病率年均增長(zhǎng)20.92%［1］。神經(jīng)梅毒是三期梅毒的表現(xiàn)形式之一，它是由梅毒螺旋體侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的一種慢性感染性疾病，國(guó)內(nèi)已有學(xué)者研究本病的臨床特點(diǎn)，但尚無(wú)發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道［2-3］。神經(jīng)梅毒作為一種經(jīng)血源播散的感染性疾病，血液循環(huán)中的梅毒螺旋體粘附并穿越血腦屏障是神經(jīng)梅毒發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵步驟之一。但人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human brain microvascular endothelial cells，HBMEC）作為血腦屏障的重要組成部分，與外周血管內(nèi)皮細(xì)胞存在較大差異，如細(xì)胞間存在大量的緊密連接，內(nèi)皮細(xì)胞跨膜電阻高，缺乏胞飲囊泡等［4］。本研究將梅毒螺旋體與原代HBMEC混合培養(yǎng)，采用掃描電鏡技術(shù)和暗視野顯微鏡檢查計(jì)數(shù)法觀察梅毒螺旋體與HBMEC的粘附情況，為進(jìn)一步研究神經(jīng)梅毒的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和新的研究思路。

材料和方法

一、材料

1.動(dòng)物及細(xì)胞來(lái)源：3月齡成年雄性新西蘭大白兔購(gòu)自江蘇省金陵種兔場(chǎng)，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心按要求喂養(yǎng)，合格證號(hào)為201403098。體重2.5～3 kg，快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實(shí)驗(yàn)（RPR）陰性。梅毒螺旋體Nichols株由廈門(mén)大學(xué)附屬中山醫(yī)院楊天賜教授饋贈(zèng)。原代HBMEC生產(chǎn)于Cell Systems公司。

2.主要試劑與儀器：內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)液（美國(guó)Cell Systems公司），EDTA-胰蛋白酶消化液（美國(guó)Gibco公司），暗視野顯微鏡（日本Nikon公司），EX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），S-3000N型掃描電鏡（日本Hitachi公司）。

二、方法

1.原代HBMEC的復(fù)蘇與培養(yǎng)：從液氮容器中取出HBMEC凍存管，迅速置于37℃水浴鍋中后，200×g離心5 min，棄上清液。內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃5%CO2培養(yǎng)，選擇3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.梅毒螺旋體培養(yǎng)：雙側(cè)兔睪丸分別注射1×107～3×107條梅毒螺旋體，每周觀察3次兔睪丸的大小和硬度，判斷是否形成睪丸炎，睪丸炎明顯時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，無(wú)菌條件下取下雙側(cè)睪丸，組織剪碎后加提取液于室溫下振蕩30 min，取組織液于室溫下1000×g離心10min，取上清液，4℃下12000×g離心30 min。移去上清液，加適量細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋沉淀物至 4 × 106條/ml、8 × 106條/ml、1.6 × 107條/ml。

3.掃描電鏡觀察：將直徑為14 mm的圓形蓋玻片置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×105個(gè)HBMEC，37℃5%CO2培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞融合達(dá)40%左右用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前2 h移去舊培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，然后加入1.6×107條/ml梅毒螺旋體懸液，于混合培養(yǎng)0.5、2、4 h后取出蓋玻片，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，加預(yù)冷的2.5%戊二醛4℃固定16 h，1%鋨酸固定1 h，乙醇梯度脫水，冷凍，噴金，掃描電鏡下觀察并照相。

4.梅毒螺旋體粘附實(shí)驗(yàn)：HBMEC培養(yǎng)方法同上，細(xì)胞融合達(dá)40%左右用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前2 h移去舊培養(yǎng)液，換新鮮培養(yǎng)液，加入不同密度（4×106/ml、8× 106/ml、1.6× 107/ml）梅毒螺旋體懸液，每孔 500 μl，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)，于混合培養(yǎng) 2、4、6、16 h 后移除上清液，取出蓋玻片，PBS沖洗3次，暗視野顯微鏡下計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞上粘附的梅毒螺旋體數(shù)目，重復(fù)觀察3次，獨(dú)立進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)。

結(jié) 果

一、掃描電鏡觀察

梅毒螺旋體主體呈均勻的細(xì)條型，含8～12個(gè)螺旋，兩端逐漸變尖，呈錐形，無(wú)法辨別頭端和尾端。混合培養(yǎng)0.5 h后就有梅毒螺旋體粘附于HBMEC表面（圖1A）?；旌吓囵B(yǎng)2、4 h后，HBMEC表面吸附的梅毒螺旋體數(shù)量逐漸增加，且表現(xiàn)為集中吸附于HBMEC細(xì)胞膜的某一區(qū)域（圖1B、1C）?；旌吓囵B(yǎng)4 h，可見(jiàn)多條梅毒螺旋體吸附于細(xì)胞膜上相近位置（圖1D、1E、1F），有1條梅毒螺旋體已部分進(jìn)入HBMEC下方，另外一部分位于細(xì)胞外（圖1E）；有2條梅毒螺旋體與HBMEC粘附的部位已經(jīng)與細(xì)胞膜部分融合（圖1F）。

二、梅毒螺旋體與HBMEC的粘附情況

加入不同密度的梅毒螺旋體懸液與HBMEC混合培養(yǎng)后，不同培養(yǎng)時(shí)間及不同密度組間梅毒螺旋體粘附數(shù)目差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=387.72、593.23，均P＜0.001），且培養(yǎng)時(shí)間與密度存在交互作用（F=98.74，P＜0.001），即不同密度組梅毒螺旋體粘附數(shù)目隨時(shí)間變化的趨勢(shì)不同（表1）。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng)，在固定梅毒螺旋體懸液各密度條件下，不同時(shí)間點(diǎn)之間的梅毒螺旋體粘附數(shù)目比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)不同密度組梅毒螺旋體粘附數(shù)目比較，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。在3個(gè)不同密度組中，梅毒螺旋體粘附數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，6 h時(shí)達(dá)到高峰，然后呈下降趨勢(shì)。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，4×106條/ml和8×106條/ml組中4和6 h間粘附數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8×106條/ml組2和16 h間粘附數(shù)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.374、0.922、0.206），其余時(shí)間點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；1.6×107條/ml組中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)粘附數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.001）。此外，除培養(yǎng)2h時(shí)8×106條/ml和1.6×107條/ml組的粘附數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.730），其余各時(shí)間點(diǎn)各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 梅毒螺旋體與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）粘附的掃描電鏡觀察 1A：混合培養(yǎng)0.5 h，可見(jiàn)梅毒螺旋體與HBMEC粘附；1B：混合培養(yǎng)2 h；1C：混合培養(yǎng)4 h，HBMEC吸附的梅毒螺旋體數(shù)量逐漸增加；1D：混合培養(yǎng)4 h，數(shù)條梅毒螺旋體集中粘附于細(xì)胞膜上；1E：混合培養(yǎng)4 h，1條梅毒螺旋體部分“鉆入”HBMEC下方，而細(xì)胞膜表面完整；1F：混合培養(yǎng)4 h，在吸附部位梅毒螺旋體末端與細(xì)胞膜發(fā)生融合

表1 梅毒螺旋體與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間的粘附情況

討 論

神經(jīng)梅毒是梅毒螺旋體感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)后引起的一種感染性疾病，本病發(fā)病隱匿，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣且缺乏特征性，是一種誤診率高達(dá)73.3%的疾?。?］。梅毒螺旋體作為一種侵襲性病原菌已被證實(shí)可在體外培養(yǎng)環(huán)境下粘附并穿越人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和Hela細(xì)胞等多種人體細(xì)胞［6-7］。本研究選擇原代HBMEC作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，加入具有活力的梅毒螺旋體混合培養(yǎng)，利用掃描電鏡和暗視野顯微鏡觀察梅毒螺旋體與細(xì)胞的粘附情況。結(jié)果顯示，梅毒螺旋體的粘附率整體呈現(xiàn)先上升，4 h達(dá)最大值，而后逐漸下降的趨勢(shì)。Hayes 等［8］將梅毒螺旋體分別與兔睪丸細(xì)胞和HEP-2在不同的溫度下混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，細(xì)胞上粘附的梅毒螺旋體數(shù)量逐漸增加，37℃時(shí)粘附率最高，且在2 h時(shí)梅毒螺旋體的粘附數(shù)量達(dá)到最大，指出梅毒螺旋體的粘附程度依賴(lài)于培養(yǎng)溫度和梅毒螺旋體的活力。因?yàn)槊范韭菪w缺乏某些物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，所以必須依賴(lài)宿主提供的營(yíng)養(yǎng)成分才能增殖和致病，利用與動(dòng)物細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)的方法可延長(zhǎng)梅毒螺旋體的存活時(shí)間和毒力保持時(shí)間［9-11］。我們?cè)诎狄曇帮@微鏡下觀察到粘附在細(xì)胞上的梅毒螺旋體仍具有活力，部分梅毒螺旋體甚至呈高速螺旋式運(yùn)動(dòng)，而部分未粘附的梅毒螺旋體也具有活力，混合培養(yǎng)16 h后粘附的梅毒螺旋體仍具有較高的活性。

在體內(nèi)，當(dāng)梅毒螺旋體引起播散性系統(tǒng)感染時(shí)，傾向粘附于具有高濃度糖胺聚糖的組織或代謝旺盛的組織，如真皮、睪丸、主動(dòng)脈、眼、胎盤(pán)、臍帶等［12］。梅毒螺旋體離開(kāi)宿主后迅速失去活力，逐漸喪失對(duì)細(xì)胞的粘附能力，數(shù)小時(shí)后死亡。將梅毒螺旋體與不同來(lái)源的細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)，梅毒螺旋體傾向粘附于生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞上，而粘附于細(xì)胞的梅毒螺旋體比未粘附的梅毒螺旋體的存活時(shí)間更長(zhǎng)，提示梅毒螺旋體與細(xì)胞的粘附情況還依賴(lài)于宿主的代謝狀態(tài)。雖然粘附在梅毒螺旋體感染過(guò)程中的作用尚未完全清楚，但研究者推測(cè)，一方面粘附于宿主細(xì)胞可以為梅毒螺旋體提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，減少氧氣對(duì)梅毒螺旋體的毒性，另一方面粘附可能直接與梅毒螺旋體的增殖有關(guān)［13］。HBMEC作為血腦屏障的重要組成部分，其代謝旺盛，生化特性不同于外周血管內(nèi)皮細(xì)胞，梅毒螺旋體粘附于HBMEC的分子機(jī)制尚需深入研究和探索。

掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)了一些暗視野顯微鏡和相差顯微鏡下無(wú)法觀察到的粘附細(xì)節(jié)?；旌吓囵B(yǎng)0.5 h后就觀察到梅毒螺旋體粘附于HBMEC上，隨著混合培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，HBMEC表面粘附的梅毒螺旋體數(shù)量逐漸增加，且呈現(xiàn)出群集吸附于細(xì)胞膜上的現(xiàn)象。粘附的聚集現(xiàn)象可能與細(xì)胞膜的流動(dòng)性有關(guān)，細(xì)胞受到梅毒螺旋體刺激后，表面的受體隨細(xì)胞膜的流動(dòng)聚集于最初的粘附部位，進(jìn)而吸引更多的梅毒螺旋體粘附于該處細(xì)胞膜表面。Fitzgerald等［14］利用掃描電鏡觀察梅毒螺旋體與兔睪丸細(xì)胞和人皮膚上皮細(xì)胞的粘附情況，發(fā)現(xiàn)在粘附部位梅毒螺旋體本身和細(xì)胞表面均未觀察到結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化，指出梅毒螺旋體與細(xì)胞的粘附似乎是一種物理靠近。研究證實(shí)，梅毒螺旋體粘附于細(xì)胞之上并不破壞細(xì)胞的物理結(jié)構(gòu)，不影響細(xì)胞的活性，也不引起細(xì)胞凋亡［15］。但我們?cè)陔婄R下觀察到1條梅毒螺旋體的大部分已與細(xì)胞膜融合，而剩余部分仍位于細(xì)胞外（圖1E），有2條梅毒螺旋體的末端已經(jīng)與細(xì)胞膜部分融合（圖1F）。我們猜測(cè)梅毒螺旋體可能具有溶解HBMEC細(xì)胞膜的能力，但溶解過(guò)程并不引起細(xì)胞的活性改變，細(xì)胞可通過(guò)自我修復(fù)使細(xì)胞膜再度恢復(fù)完整。梅毒螺旋體也可能是通過(guò)其尖端吸附于HBMEC后，利用菌體螺旋運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的動(dòng)力從細(xì)胞邊緣“鉆”入細(xì)胞下方，進(jìn)而通過(guò)HBMEC單層。HBMEC是一種終末微血管內(nèi)皮細(xì)胞，是血腦屏障的重要組成部分，梅毒螺旋體粘附HBMEC的方式可能與梅毒螺旋體粘附于其他組織細(xì)胞的方式不同。梅毒螺旋體的粘附是否會(huì)破壞HBMEC膜的物理完整性、影響細(xì)胞的活性，是否會(huì)引起細(xì)胞的生化特性改變，還需進(jìn)一步深入探討。

本研究結(jié)果顯示，梅毒螺旋體可粘附于體外培養(yǎng)的HBMEC表面，粘附數(shù)量在混合培養(yǎng)4 h達(dá)到最大值。梅毒螺旋體與HBMEC的粘附可能涉及細(xì)胞膜表面的融合，這在神經(jīng)梅毒發(fā)病中可能起一定的作用。本研究存在兩點(diǎn)不足，一方面，利用暗視野顯微鏡進(jìn)行粘附計(jì)數(shù)不夠精確，僅能粗略地反應(yīng)每個(gè)細(xì)胞上大概粘附的梅毒螺旋體數(shù)量；另一方面，掃描電鏡照片不能觀察亞細(xì)胞水平的變化。因此，后續(xù)研究中需進(jìn)一步使用qPCR等分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)可以利用透射電鏡深入分析梅毒螺旋體與HBMEC粘附的作用方式。

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