菱花粉生活力測(cè)定方法研究

李雙梅+柯衛(wèi)東+彭靜+李峰+鐘蘭+孫亞林

摘 要：為了探索菱花粉生活力的最佳測(cè)定方法，以孝感紅菱花粉為試材，利用無機(jī)鹽培養(yǎng)法、MTT（四甲基噻唑藍(lán)）染色法和TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法對(duì)花粉生活力進(jìn)行測(cè)定。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加低濃度的蔗糖和硼酸對(duì)菱花粉的萌發(fā)有促進(jìn)作用，菱花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸，萌發(fā)率達(dá)65.9%；用MTT染色法和TTC染色法測(cè)定菱花粉生活力，染色率僅為36.9%和27.1%，效果不理想。

關(guān)鍵詞：菱；花粉；生活力；萌發(fā)率

中圖分類號(hào)：S645.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1001-3547（2014）18-0045-03

菱（Trapa spp.），別名菱角、龍角、水粟等，為菱科菱屬一年生水生草本植物，起源于歐洲和亞洲的溫暖地區(qū)[1]，中國(guó)是菱的原產(chǎn)地之一[2]。菱在中國(guó)的分布范圍較廣，中國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南各省、自治區(qū)均有栽培。

研究菱花粉生活力對(duì)雜交育種及種質(zhì)創(chuàng)新有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者在菱的分類[3]、形態(tài)學(xué)[4]、細(xì)胞學(xué)[5]、生理生化[6]、栽培技術(shù)[7]等方面做了大量工作，在菱屬植物傳粉生物學(xué)方面也有少量研究[8]，而有關(guān)適宜菱花粉生活力測(cè)定方法的研究卻未見報(bào)道?；ǚ凵盍y(cè)定的方法很多，主要有顯微鏡形態(tài)觀測(cè)法、染色法、培養(yǎng)基發(fā)芽法等[9]。本文采用無機(jī)鹽培養(yǎng)法、MTT染色法和TTC染色法對(duì)孝感紅菱花粉生活力進(jìn)行測(cè)定，以期找到菱花粉生活力測(cè)定的最佳方法，為菱的雜交育種及種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2012年8月在國(guó)家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃采集孝感紅菱萼片剛開裂的花蕾。剝?nèi)』ㄋ?，放入培養(yǎng)皿中，置于（25±1）℃的電熱恒溫箱中培養(yǎng)4～5 h，收集花粉備用[10]。

1.2 花粉生活力的測(cè)定方法

①無機(jī)鹽培養(yǎng)法 無機(jī)鹽基液的配制參照胡適宜[11]的方法。取硼酸（H3BO3）0.1 g、硝酸鈣（Ca（NO3）2·4H2O）0.3 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.1 g、硝酸鉀（KNO3）0.1 g，配制成100 mL無機(jī)鹽基液。設(shè)5%、10%、15%、20%、25%、30% 6種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖和0、0.005%、0.01%、0.015% 4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)硼酸的完全隨機(jī)試驗(yàn)，共24個(gè)處理，A，5%蔗糖；B，5%蔗糖+0.005%硼酸；C，5%蔗糖+0.01%硼酸；D，5%蔗糖+0.015%硼酸；E，10%蔗糖；F，10%蔗糖+0.005%硼酸；G，10%蔗糖+0.01%硼酸；H，10%蔗糖+0.015%硼酸；I，15%蔗糖；J，15%蔗糖+0.005%硼酸；K，15%蔗糖+0.01%硼酸；L，15%蔗糖+0.015%硼酸；M，20%蔗糖；N，20%蔗糖+0.005%硼酸；O，20%蔗糖+0.01%硼酸；P，20%蔗糖+0.015%硼酸；Q，25%蔗糖；R，25%蔗糖+0.005%硼酸；S，25%蔗糖+0.01%硼酸；T，25%蔗糖+0.015%硼酸；U，30%蔗糖；V，30%蔗糖+0.005%硼酸；W，30%蔗糖+0.01%硼酸；X，30%蔗糖+0.015%硼酸。取少量菱花粉于載玻片上，分別加1～2滴上述培養(yǎng)液，將制備好的片子放在墊有二層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于（25±1）℃條件下培養(yǎng)，3～4 h后觀察花粉萌發(fā)率。

②MTT染色法 MTT溶液配制參照張研等[12]的方法。稱0.5 g MTT于燒杯，溶解于5%蔗糖溶液25 mL中，后裝入棕色試劑瓶，置于冰箱中避光保存。取少量菱花粉于載玻片上，加1～2滴配制好的MTT溶液，蓋上蓋玻片，在室溫下放置10 min，然后在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察。染成紫色的花粉生活力強(qiáng)，染成淡紅色的生活力次之，不能染色的是沒有生活力的花粉或不育花粉。

③TTC染色法 取少量菱花粉放到載玻片上，加1～2滴0.5% TTC溶液，攪拌均勻，蓋上蓋玻片，將其在（35±1）℃電熱恒溫箱內(nèi)放置15～20 min。然后在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察，被染成紅色的花粉生活力強(qiáng)，被染成淡紅色的花粉生活力次之，不能染色的花粉為失去生活力的花粉或不育花粉。

以上每種方法觀察3個(gè)制片，每個(gè)制片觀察5個(gè)視野，分別統(tǒng)計(jì)有生活力花粉粒數(shù)和無生活力花粉粒數(shù)，計(jì)算花粉的活力百分率。花粉活力百分率的計(jì)算公式為花粉活力百分率（%）=（有活力花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%；花粉萌發(fā)率的計(jì)算公式為花粉萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔗糖、硼酸對(duì)花粉萌發(fā)的影響

從表1可看出，在無添加硼酸、5%～30%蔗糖濃度下（處理A、E、I、M、Q、U），花粉萌發(fā)率極低，幾乎不發(fā)芽；在0.015%硼酸、5%～30%蔗糖濃度下（處理D、H、L、P、T、X），花粉萌發(fā)率也不高，在 2.0%～32.0%；在5%和30%蔗糖濃度下（處理A、B、C、D和處理U、V、W、X），花粉萌發(fā)率也很低，在0～39.4%；以10%蔗糖+0.005%硼酸（處理F）花粉萌發(fā)率最高，達(dá)65.9%，其次是15%蔗糖+0.005%硼酸（處理J），花粉萌發(fā)率達(dá)57.9%，再次是10%蔗糖+0.01%硼酸（處理G）和20%蔗糖+0.005%硼酸（處理N），花粉萌發(fā)率分別為51.0%和50.5%，表明菱花粉在低濃度蔗糖和低濃度硼酸下萌發(fā)率高。綜合來看，本試驗(yàn)中以10%蔗糖+0.005%硼酸最適合菱花粉萌發(fā)。

2.2 MTT染色法菱花粉生活力的測(cè)定結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察，用MTT染色后，染成紫色和淡紅色（有生活力）的花粉占36.9%，不能染色（沒有生活力）的花粉占63.1%，測(cè)定結(jié)果明顯偏低于無機(jī)鹽培養(yǎng)法最佳培養(yǎng)基測(cè)定菱花粉的萌發(fā)率（65.9%），不能真實(shí)反映菱花粉的生活力。因此，MTT染色法不適宜作為菱花粉生活力的測(cè)定方法。

2.3 TTC染色法菱花粉生活力的測(cè)定結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用TTC染色后，染成紅色和淡紅色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（沒有生活力）的花粉占72.9%，此方法測(cè)定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不適宜作為菱花粉生活力的測(cè)定方法。

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基發(fā)芽法是花粉生活力應(yīng)用較廣泛的一種方法，測(cè)定結(jié)果較精確可靠[13]。有研究認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的蔗糖和硼酸利于花粉萌發(fā)。蔗糖不僅為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，還維持花粉與培養(yǎng)液之間的滲透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促進(jìn)糖的吸收和代謝，與糖結(jié)合可以提高花粉的萌發(fā)率，增加氧氣的含量和吸收，參與果膠物質(zhì)的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分別采用不同濃度的蔗糖和不同濃度的硼酸進(jìn)行完全隨機(jī)試驗(yàn)，結(jié)果表明，最適宜菱花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸，萌發(fā)率達(dá)65.9%。

測(cè)定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，還有I2-KI染色法、醋酸洋紅染色法和亞甲基藍(lán)染色法等[9]，不同染色法只適合某些植物花粉生活力的測(cè)定[9]。本試驗(yàn)中采用MTT法和TTC法測(cè)定菱花粉生活力，染色率均較低，不能真實(shí)反映菱花粉生活力，2種方法均不宜用于測(cè)定菱花粉生活力，同樣也證明了以上觀點(diǎn)。相比較而言，MTT染色法稍接近無機(jī)鹽培養(yǎng)法的測(cè)定結(jié)果，采用不同時(shí)期的菱花粉，選用無機(jī)鹽培養(yǎng)法和MTT染色法進(jìn)行比較測(cè)定，看是否能找到這2種方法在菱花粉生活力測(cè)定上的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 李曙軒.中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書·蔬菜卷[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1990：144-146.

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[9] 賈文慶，劉會(huì)超，李保栓.榆葉梅花粉生活力及貯藏特性的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，（9）：39-40.

[10] 賈文慶，劉會(huì)超，姚連芳.紫薇花粉萌發(fā)特性研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22（6）：18-20.

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[12] 張研，楊發(fā)君，田義新.穿龍薯蕷花粉活力及柱頭可授性測(cè)定方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2 344-

2 346.

[13] 賈文慶，劉會(huì)超.垂絲海棠花粉生活力測(cè)定的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（1）：32-34.

[14] 何莉，賈文慶.郁李花粉生活力及貯藏特性的研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（5）：5-8.

[15] 崔曉龍，魏蓉城，黃瑞復(fù).蘋果花粉生活力的研究[J].云南大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1995，17（3）：284-289.

2.3 TTC染色法菱花粉生活力的測(cè)定結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用TTC染色后，染成紅色和淡紅色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（沒有生活力）的花粉占72.9%，此方法測(cè)定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不適宜作為菱花粉生活力的測(cè)定方法。

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基發(fā)芽法是花粉生活力應(yīng)用較廣泛的一種方法，測(cè)定結(jié)果較精確可靠[13]。有研究認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的蔗糖和硼酸利于花粉萌發(fā)。蔗糖不僅為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，還維持花粉與培養(yǎng)液之間的滲透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促進(jìn)糖的吸收和代謝，與糖結(jié)合可以提高花粉的萌發(fā)率，增加氧氣的含量和吸收，參與果膠物質(zhì)的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分別采用不同濃度的蔗糖和不同濃度的硼酸進(jìn)行完全隨機(jī)試驗(yàn)，結(jié)果表明，最適宜菱花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸，萌發(fā)率達(dá)65.9%。

測(cè)定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，還有I2-KI染色法、醋酸洋紅染色法和亞甲基藍(lán)染色法等[9]，不同染色法只適合某些植物花粉生活力的測(cè)定[9]。本試驗(yàn)中采用MTT法和TTC法測(cè)定菱花粉生活力，染色率均較低，不能真實(shí)反映菱花粉生活力，2種方法均不宜用于測(cè)定菱花粉生活力，同樣也證明了以上觀點(diǎn)。相比較而言，MTT染色法稍接近無機(jī)鹽培養(yǎng)法的測(cè)定結(jié)果，采用不同時(shí)期的菱花粉，選用無機(jī)鹽培養(yǎng)法和MTT染色法進(jìn)行比較測(cè)定，看是否能找到這2種方法在菱花粉生活力測(cè)定上的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

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2.3 TTC染色法菱花粉生活力的測(cè)定結(jié)果

通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，用TTC染色后，染成紅色和淡紅色（有生活力）的花粉占27.1%，不能染色（沒有生活力）的花粉占72.9%，此方法測(cè)定的菱花粉生活力更低。因此，TTC染色法也不適宜作為菱花粉生活力的測(cè)定方法。

3 結(jié)論與討論

培養(yǎng)基發(fā)芽法是花粉生活力應(yīng)用較廣泛的一種方法，測(cè)定結(jié)果較精確可靠[13]。有研究認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的蔗糖和硼酸利于花粉萌發(fā)。蔗糖不僅為花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)提供養(yǎng)分，還維持花粉與培養(yǎng)液之間的滲透平衡，防止花粉和花粉管破裂[14]。硼酸能促進(jìn)糖的吸收和代謝，與糖結(jié)合可以提高花粉的萌發(fā)率，增加氧氣的含量和吸收，參與果膠物質(zhì)的合成[15]，有利于花粉管的建造[13]。本文分別采用不同濃度的蔗糖和不同濃度的硼酸進(jìn)行完全隨機(jī)試驗(yàn)，結(jié)果表明，最適宜菱花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.005%硼酸，萌發(fā)率達(dá)65.9%。

測(cè)定花粉生活力的染色方法除MTT染色法和TTC染色法外，還有I2-KI染色法、醋酸洋紅染色法和亞甲基藍(lán)染色法等[9]，不同染色法只適合某些植物花粉生活力的測(cè)定[9]。本試驗(yàn)中采用MTT法和TTC法測(cè)定菱花粉生活力，染色率均較低，不能真實(shí)反映菱花粉生活力，2種方法均不宜用于測(cè)定菱花粉生活力，同樣也證明了以上觀點(diǎn)。相比較而言，MTT染色法稍接近無機(jī)鹽培養(yǎng)法的測(cè)定結(jié)果，采用不同時(shí)期的菱花粉，選用無機(jī)鹽培養(yǎng)法和MTT染色法進(jìn)行比較測(cè)定，看是否能找到這2種方法在菱花粉生活力測(cè)定上的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

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