適用于本科教學(xué)的新酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

吳梅芬, 王曉崗, 劉亞菲, 許新華

（同濟(jì)大學(xué) 化學(xué)系, 上海 200092）

實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究

適用于本科教學(xué)的新酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究

吳梅芬, 王曉崗, 劉亞菲, 許新華

（同濟(jì)大學(xué) 化學(xué)系, 上海 200092）

通過嚴(yán)格的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)推導(dǎo),得到了-糜蛋白酶催化三甲基乙酸對(duì)硝基苯酯水解反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的表達(dá)式,包括表觀米氏常數(shù)KM、酶-底物絡(luò)合物穩(wěn)定常數(shù)K、催化速率常數(shù)kcat、以及基元反應(yīng)步驟速率常k2和k3等。實(shí)驗(yàn)在25 ℃,pH =8.5的三羥基氨基甲烷緩沖液中進(jìn)行,用分光光度法測(cè)定反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線。數(shù)據(jù)經(jīng)過非線性擬合和線性擬合,得到相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),該參數(shù)與理論預(yù)測(cè)一致。該實(shí)驗(yàn)酶制劑價(jià)格低廉,活性穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單,可作為本科物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中復(fù)雜反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)量的一個(gè)很好的實(shí)例,加深學(xué)生對(duì)化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)相關(guān)理論和概念的理解和掌握。

酶催化； 復(fù)雜反應(yīng)； 化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)； 實(shí)驗(yàn)教學(xué)

酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛏鷦?dòng)展示復(fù)雜反應(yīng)過程的細(xì)節(jié),是學(xué)生理解化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論的良好實(shí)例[1-2]。國(guó)內(nèi)高校在生化專業(yè)實(shí)驗(yàn)課程中開設(shè)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)方法均以生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)為主[3-8]。但是,這些實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)根據(jù)的是并不準(zhǔn)確的米開利-蒙頓（Mechaelis-Menten）機(jī)理[9],也并不嚴(yán)格遵循化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的原則,實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)往往以產(chǎn)物濃度對(duì)反應(yīng)時(shí)間的比值作為瞬時(shí)反應(yīng)速率，不夠嚴(yán)謹(jǐn)。在國(guó)內(nèi)高校的物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中,酶催化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目比較少[10],實(shí)驗(yàn)對(duì)象以蔗糖酶為主。由于實(shí)驗(yàn)課時(shí)有限等原因,酶的提取和純化過程重現(xiàn)性較差,實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果不夠理想。

本文提出一種適用于高校本科教學(xué)的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)新實(shí)驗(yàn)——-糜蛋白酶催化酯類化合物水解反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)的常用方法——分光光度法,催化劑是商品化的酶制劑,品質(zhì)有保證且價(jià)格較低,能夠滿足眾多學(xué)生實(shí)驗(yàn)的成本控制需求。更為重要的是,經(jīng)過對(duì)該反應(yīng)機(jī)理的深入研究,該方法不符合簡(jiǎn)單的米開利-蒙頓機(jī)理,這就使得學(xué)生在分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)時(shí),必須嚴(yán)格按照化學(xué)動(dòng)力學(xué)原則進(jìn)行邏輯分析。由于該反應(yīng)機(jī)理足夠復(fù)雜,包含多種常見復(fù)雜反應(yīng)類型（如對(duì)峙反應(yīng)、連續(xù)反應(yīng)等）,對(duì)學(xué)生全面理解和掌握化學(xué)動(dòng)力學(xué)原理和計(jì)算方法是一個(gè)很好的訓(xùn)練。

1 反應(yīng)機(jī)理和動(dòng)力學(xué)模型

本文采用的酶催化底物為三甲基乙酸對(duì)硝基苯酯（4-nitrophenyl-trimethylacetate,用S表示）,在-糜蛋白酶（-Chymotrypsin,用E表示）的催化下水解生成對(duì)硝基苯酚（4-nitrophenol,用P1表示）和三甲基乙酸（trimethylacetic acid,用P2表示）,反應(yīng)在pH=8左右的堿性緩沖水溶液中進(jìn)行,生成的產(chǎn)物以其共軛堿的形式存在。反應(yīng)方程如下:

實(shí)驗(yàn)測(cè)得,當(dāng)酶與底物混合后,產(chǎn)物P1立刻有“爆發(fā)性”的增長(zhǎng),然后P1的濃度進(jìn)入平緩增長(zhǎng)期。這個(gè)現(xiàn)象不符合傳統(tǒng)的米開利-蒙頓機(jī)理。根據(jù)Bender及其同事提出的-糜蛋白酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型[11-13],可以假設(shè)如下反應(yīng)機(jī)理:

可逆酶-底物鍵合

AE表示乙酰化酶假定底物初始濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶初始濃度,即C0（S）?C0（E）,為推導(dǎo)P1濃度C（P1）與時(shí)間t之間的關(guān)系,寫出微分方程:

（1）

（2）

（3）

酶的物質(zhì)平衡關(guān)系為

C0（E）=C（E）+C（ES）+C（AE）

（4）

第一步快速預(yù)平衡步驟有

（5）

根據(jù)式（1）—式（5）,可以得到:

（6）

（7）

式中參數(shù)

（8）

將方程（7）代入方程（1）,積分后得到

C（P1）=mt+n（1-e-b t）

（9）

式中

（10）

圖1是根據(jù)方程（9）繪制的曲線,與實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果完全相符。

圖1 產(chǎn)物P1濃度與時(shí)間關(guān)系曲線

2 動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法

如果底物同時(shí)進(jìn)行著酶催化水解反應(yīng)和非催化水解反應(yīng),這兩個(gè)反應(yīng)都產(chǎn)生P1,能夠被光譜儀檢測(cè)。當(dāng)計(jì)算酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)時(shí),必須先扣除非催化水解反應(yīng)的本底數(shù)據(jù)。

C0（E）act=xC0（E）total

（11）

式中x是粗酶原料的純度百分?jǐn)?shù)。通過動(dòng)力學(xué)測(cè)量,可以估算x值。

如果固定粗酶濃度C0（E）total,然后測(cè)定一系列初始濃度C0（S）下的C（P1）-t關(guān)系曲線,通過曲線擬合得到一系列m、n、b參數(shù)。

首先考慮m,將參數(shù)a、b的定義式（8）代入方程（10）,并變形為

（12）

式中

（13）

m的量綱是“濃度時(shí)間-1”（如mol·dm-3·s-1）,與反應(yīng)速率量綱相同。以作圖得一直線,由直線的斜率和截距可以計(jì)算出表觀米氏常數(shù)KM；如果已知活性酶濃度C0（E）act,則可以計(jì)算出催化速率常數(shù)kcat。

n≈C0（E）cat

（14）

即由參數(shù)n能夠直接得到活性酶濃度C0（E）act,根據(jù)方程（11）可以估算粗酶的純度百分?jǐn)?shù)x,并可計(jì)算出kcat。

若僅測(cè)量一個(gè)底物初始濃度的實(shí)驗(yàn)曲線,在C0（S）?KM條件下,m可以簡(jiǎn)化為

m=kcatC0（E）act

（15）

如果已知活性酶濃度C0（E）act,就可以由m直接計(jì)算出kcat。

按同樣方法將b參數(shù)也表達(dá)成雙倒數(shù)形式

（16）

3 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)（Agilent 8453）,三羥甲基氨基甲烷（A.R.）,鹽酸（A.R.）,三甲基乙酸對(duì)硝基苯酯（A.R.）,對(duì)硝基苯酚（A.R.）,-糜蛋白酶（800 usp unit/mg,阿拉丁試劑）。

4 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）配制溶液。溶液a:濃度為0.01 mol·dm-3、pH=8.5的三羥甲基氨基甲烷（TRIS）緩沖液,pH值用鹽酸調(diào)節(jié)；溶液b:用乙腈溶解三甲基乙酸對(duì)硝基苯酯,配成濃度約為3×10-3mol·dm-3的溶液；溶液c:取50 mg-糜蛋白酶用水稀釋至1 mL,酶濃度2.0×10-3mol·dm-3,冰水浴冷卻備用。

（2） 測(cè)定實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)硝基苯酚的吸光系數(shù)。用TRIS緩沖液配制濃度約為3×10-5mol·dm-3的對(duì)硝基苯酚溶液,在分光光度計(jì)上測(cè)定溶液的吸光度,并計(jì)算吸光系數(shù),測(cè)定波長(zhǎng)400 nm,以TRIS緩沖液為參比。

（3） 測(cè)定非催化條件下酯水解反應(yīng)的本底曲線。在干凈的石英比色皿中加入3 mL溶液a,然后加入100 μL溶液b,混合均勻。在25C下定波長(zhǎng)400 nm測(cè)量溶液的吸光度隨時(shí)間變化曲線,共計(jì)記錄約2 000 s。

（4） 測(cè)定酶催化條件下酯水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線。在干凈的石英比色皿中加入3 mL溶液a和40 μL溶液b,混合均勻,然后立即注入80 μL溶液c并混合均勻。25C下定波長(zhǎng)400 nm測(cè)量溶液的吸光度隨時(shí)間變化曲線,共計(jì)記錄約2 000 s,起始時(shí)間為注入溶液c的時(shí)刻。反應(yīng)條件下粗酶濃度為5×10-5mol·dm-3。

控制其他條件不變,將溶液b的加入體積依次改變?yōu)?0、60、70、90、100 μL,測(cè)定不同底物濃度下的酶催化酯水解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。

5 結(jié)果與討論

圖2 不同初始底物濃度條件下產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚（P1）濃度隨反應(yīng)時(shí)間變化曲線

表1 不同初始底物濃度下的擬合參數(shù)

校正確定系數(shù)Adj.R2=0.975 48

校正確定系數(shù)Adj.R2= 0.943 86

圖3 1/m-1/C0（S）關(guān)系線性擬合曲線

圖4 1/b-1/C0（S）關(guān)系線性擬合曲線

KM=1.86×10-5mol·dm-3

kcat=5.90×10-4s-1

K=1.01×10-4mol·dm-3

k2=2.06×10-2s-1

k3=6.32×10-4s-1

由此可見k2?k3,kcat≈k3,且kcat略小于k3,與理論預(yù)測(cè)一致。

根據(jù)方程（11）,可以估算粗酶的純度x= 34%。

6 結(jié)論

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Research on a novel kinetics experiment of enzyme-catalyzed reaction presented for undergraduate teaching

Wu Meifen, Wang Xiaogang, Liu Yafei, Xu Xinhua

（Department of Chemistry,Tongji University,Shanghai 200092,China）

The mechanism of-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of 4-nitrophenyl trimethylacetate includes the following steps: the reversible enzyme-substrate binding and the enzyme acylation and enzyme deacylation. This mechanism is quite different from the conventional Michaelis-Menten mechanism for enzyme-catalyzed reactions. The corresponding kinetic parameters can be expressed precisely on the basis of chemical kinetics theory, such as Michaelis constantKM, equilibrium constantK, catalytic rate constantkcat, and the rate constants of the elementary reactionsk2andk3. The reaction is carried out at 25C in a pH = 8.5 buffer of tris（hydroxymethyl）aminomethane （TRIS） by means of spectrophotometry. The kinetic curves are fitted linearly and non-linearly. The kinetic parameters are in agreement with the theoretical prediction. The enzyme product used in this experiment is cheap and the activity is stable. The experimental method is simple enough to be applied in undergraduate physical chemistry laboratory courses. As an ideal model of complex reaction, the experiment will help the students to enhance the understanding and knowledge of chemical kinetics theories.

enzyme-catalysis; complex reaction; chemical kinetics; experimental teaching

2015- 04- 07

同濟(jì)大學(xué)第八期精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目建設(shè)（1380104084）；同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教改項(xiàng)目建設(shè)（1380104081）

吳梅芬（1970—）,女,上海,博士,高級(jí)工程師,從事物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作

E-mail：wumf@#edu.cn

許新華（1967—）,男,浙江黃巖,博士,副教授,從事物理化學(xué)及實(shí)驗(yàn)的教學(xué)工作.

E-mail：xxh01@#edu.cn

O642; TG146

A

1002-4956（2015）11- 0170- 04