血管性認(rèn)知障礙小鼠腦內(nèi)少突膠質(zhì)細(xì)胞再生分化障礙特點(diǎn)研究

李海龍，鄭惠文，劉敏，黎佳思，王云霞，趙善民，畢曉瑩（并列第一作者）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是全球?qū)е掳V呆的第二位疾病，僅次于阿爾茨海默癥[1]。缺血性腦血管病變所引起的額葉、顳葉、邊緣系統(tǒng)等部位神經(jīng)元大量死亡是引起其認(rèn)知障礙重要的病理基礎(chǔ)，但目前針對(duì)其認(rèn)知功能的下降尚無有效的治療。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在成年哺乳動(dòng)物的腦內(nèi)存在大量的神經(jīng)干/祖細(xì)胞，且這些細(xì)胞終身具有產(chǎn)生新生神經(jīng)元的能力[1-2]。室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）及海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）的顆粒下層（subgranular zone，SGZ）是神經(jīng)干/祖細(xì)胞分化產(chǎn)生新生神經(jīng)細(xì)胞的主要區(qū)域。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血可誘發(fā)成年沙鼠持續(xù)的神經(jīng)再生[3]，且脫髓鞘損傷后少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（oligodendrocyte progenitorcells，OPCs）數(shù)量反應(yīng)性增多[4]。促進(jìn)血管性癡呆中受損神經(jīng)元的再生修復(fù)，從而替代死亡的神經(jīng)細(xì)胞功能可能是未來VD重要的治療靶點(diǎn)。本研究旨在通過建立VD小鼠模型，觀察全腦缺血后室管膜下區(qū)和海馬齒狀回神經(jīng)元再生以及少突膠質(zhì)細(xì)胞再生、分化、成熟的特點(diǎn)，為尋找血管性認(rèn)知障礙的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 動(dòng)物及分組 研究采用健康CD1雄性小鼠48只，8～10周，體重25～30 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。編號(hào)后采用SAS軟件隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，每組24只，造模前常規(guī)條件下飼養(yǎng)1周。

1.2 血管性癡呆小鼠模型構(gòu)建 參照通用的反復(fù)缺血再灌注法進(jìn)行血管性癡呆小鼠造模[5]。步驟如下：0.3%戊巴比妥（75 mg/kg）腹腔麻醉，取仰臥位，門齒及四肢固定，分離雙側(cè)頸動(dòng)脈，動(dòng)脈夾阻斷供血15 min后恢復(fù)供血10 min，再次阻斷供血15 min后移除動(dòng)脈夾，術(shù)中觀察小鼠呼吸、心跳，術(shù)畢縫合皮膚，置于恒溫板上復(fù)蘇，小鼠清醒后放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不阻斷頸動(dòng)脈供血外，其余手術(shù)操作與模型組相同。術(shù)后14 d和28 d每組分別隨機(jī)取12只小鼠處死后取腦組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 新生細(xì)胞標(biāo)記及取材 術(shù)后第4天起予腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，BrdU，美國Sigma公司）連續(xù)3 d（150 mg/kg，1次/日）標(biāo)記新生細(xì)胞。動(dòng)物生理鹽水灌心處死后，剝離腦組織，4%多聚甲醛固定，30%蔗糖水脫水后，制備冰凍切片，切片厚度30μm，在前囟后1.28 mm到2.12 mm間，自前向后用冰凍切片機(jī)切取腦組織冠狀面切片，裱片后-20°冰箱保存。

1.4 免疫組化染色 組織切片經(jīng)晾片、漂洗、穿膜后分別與一抗4°孵育過夜。一抗包括：小鼠BrdU單克隆抗體（1∶200稀釋，美國Sigma公司）標(biāo)記細(xì)胞增殖；兔神經(jīng)膠質(zhì)抗原2（neural/glial antigen2，NG2）抗體（1∶200稀釋，美國Millipore公司）標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞；小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞O4（oligodendrocyte marker O4）單克隆抗體（1∶300稀釋，美國Millipore公司）標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞；兔谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase pi，GST-pi）抗體（1∶250稀釋，美國Epitomics公司）標(biāo)記成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠的相應(yīng)二抗（1∶500稀釋），室溫孵育75 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，封片后顯微鏡下觀察。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)共聚焦顯像 組織切片脫氧核糖核酸變性后分別與BrdU抗體和兔神經(jīng)元特異性核蛋白（neuronal specific neucleoprotein，NeuN）抗體（1∶400，美國Abcam公司）或兔膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（1∶2000稀釋，美國Epitomics公司）的混合物4℃共同孵育過夜。再分別用相應(yīng)的熒光素標(biāo)記的二抗孵育后，封片在激光共聚焦顯微鏡下觀察神經(jīng)元的再生分化。

1.6 細(xì)胞計(jì)數(shù) 每只小鼠選取5張切片，通過觀察每張腦切片中SVZ及DG區(qū)6個(gè)不同視野免疫組化染色為陽性的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)以每mm2的細(xì)胞數(shù)表示，計(jì)算全部視野的平均值作為其對(duì)應(yīng)的細(xì)胞數(shù)。免疫熒光雙標(biāo)染色采用激光共聚焦顯微鏡成像，每張切片選5個(gè)視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行雙染細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算全部視野雙染細(xì)胞數(shù)的平均值。

2 結(jié)果

2.1 血管性癡呆小鼠室管膜下區(qū)細(xì)胞增殖和再生能力增強(qiáng) 免疫組化染色顯示，術(shù)后14 d與28 d模型組與假手術(shù)組室管膜下區(qū)BrdU陽性細(xì)胞均有表達(dá)（圖1）。術(shù)后14 d模型組與假手術(shù)組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)分別為161.1±16.9/mm2、85.7±7.3/mm2，術(shù)后28 d有所回落，分別為99.2±11.0/mm2、59.5±5.7/mm2，術(shù)后2周和4周時(shí)模型組較假手術(shù)組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增多（t=13.64，P＜0.001；t=18.79，P＜0.001）。鑒于新生神經(jīng)元形成需要一定時(shí)間周期，因此僅對(duì)術(shù)后28 d的腦組織進(jìn)行新生神經(jīng)元的觀察。采用BrdU、NeuN抗體分別標(biāo)記新生細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞核，免疫熒光雙標(biāo)共聚焦顯像，綠色熒光標(biāo)記新生細(xì)胞，紅色熒光標(biāo)記神經(jīng)元胞核（圖2A）。BrdU/NeuN雙陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后顯示，模型組與假手術(shù)組術(shù)后28 d的BrdU/NeuN雙陽性細(xì)胞數(shù)分別為66.3±4.6/mm2、37.9±5.9/mm2，模型組較假手術(shù)組新生神經(jīng)元數(shù)量顯著增多（t=13.04，P＜0.001）。

圖1 術(shù)后14 d與術(shù)后28 d室管膜下區(qū)BrdU標(biāo)記的新生細(xì)胞增殖情況對(duì)比

2.2 血管性癡呆小鼠海馬齒狀回神經(jīng)祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞再生但進(jìn)一步分化成熟障礙基于神經(jīng)祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生分化同樣具有一定的周期，故選用術(shù)后28 d的組織切片對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞再生過程中不同分化階段的細(xì)胞進(jìn)行觀察。免疫組化顯示，NG2抗體標(biāo)記的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞、O4抗體標(biāo)記的少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞、GST-pi抗體標(biāo)記的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞在兩組均有表達(dá)（圖3A、3B、3C）。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，模型組NG2陽性細(xì)胞數(shù)為511.0±22.8/mm2，假手術(shù)組NG2陽性細(xì)胞數(shù)為448.8±20.9/mm2，模型組較假手術(shù)組NG2陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P＜0.001）。模型組O4陽性細(xì)胞數(shù)為66.8±11.4/mm2，假手術(shù)組O4陽性細(xì)胞數(shù)為80.5±10.5/mm2，模型組較假手術(shù)組O4陽性細(xì)胞數(shù)量減少（P=0.006）。模型組GST-pi陽性細(xì)胞數(shù)為133.5±11.6/mm2，假手術(shù)組GST-pi性細(xì)胞數(shù)為140.2±10.9/mm2，但兩組無顯著差異（P=0.161）。

2.3 血管性癡呆小鼠海馬齒狀回新生星形膠質(zhì)細(xì)胞增多 對(duì)術(shù)后28 d的小鼠腦組織海馬齒狀回采用免疫熒光共聚焦成像進(jìn)行新生星形膠質(zhì)細(xì)胞的觀察。BrdU、GFAP抗體分別標(biāo)記新生細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，紅色熒光標(biāo)記新生細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖2B）。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，模型組與假手術(shù)組術(shù)后28 d的BrdU/GFAP雙陽性細(xì)胞分別為8±2.9/mm2、5.3±2.2/mm2，模型組較假手術(shù)組新生的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P=0.015）。

圖2 術(shù)后28 d免疫熒光雙標(biāo)SVZ新生神經(jīng)細(xì)胞與DG新生星形膠質(zhì)細(xì)胞

圖3 免疫組織化學(xué)顯示海馬齒狀回少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和成熟情況

3 討論

目前，多種血管性危險(xiǎn)因素所導(dǎo)致的腦血流低灌注而引起的腦深部白質(zhì)損傷已被認(rèn)為是血管性認(rèn)知障礙的重要病理生理基礎(chǔ)[6]。采用反復(fù)阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈模擬腦血流量下降來制備的血管性癡呆模型具有顯著的學(xué)習(xí)記憶損害[7]。我們先前的研究中發(fā)現(xiàn)，該模型動(dòng)物術(shù)后可出現(xiàn)顯著的學(xué)習(xí)記憶能力下降并伴有海馬椎體神經(jīng)元的壞死和凋亡及以少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡為表現(xiàn)的腦白質(zhì)損傷[8]。因此，該模型是研究血管性癡呆的可靠動(dòng)物模型。本研究中，我們?cè)谠撃Ｐ椭惺褂孟嚓P(guān)的神經(jīng)標(biāo)記物對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，通過與假手術(shù)的對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行對(duì)比，觀察小鼠術(shù)后2周及4周2個(gè)神經(jīng)再生區(qū)域的細(xì)胞增殖及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟情況。

室管膜下區(qū)是新生兒腦內(nèi)神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要來源，近年來的研究認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)室管膜下區(qū)同樣存在神經(jīng)再生且可在多種病理?xiàng)l件下激活[9]。本研究中通過使用BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆小鼠造模后14 d及28 d后室管膜下區(qū)BrdU標(biāo)記的新生細(xì)胞較假手術(shù)組增多，且術(shù)后14 d時(shí)最為顯著，且同時(shí)伴有新生神經(jīng)元的顯著增多。表明全腦反復(fù)缺血低灌注可誘發(fā)室管膜下區(qū)新生細(xì)胞的增殖及神經(jīng)元的內(nèi)源性再生增強(qiáng)。而有關(guān)缺血性腦損傷后神經(jīng)再生的一些研究顯示，在大腦中動(dòng)脈阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造成腦局部缺血性損傷的動(dòng)物模型中，阻斷供血后同樣出現(xiàn)了室管膜下區(qū)新生細(xì)胞的顯著增多，且在1～2周達(dá)到高峰[10-11]。這與本研究中室管膜下區(qū)新生細(xì)胞增殖的特點(diǎn)一致。但與MCAO模型不同的是，本研究?jī)H為短暫性的缺血再灌注，手術(shù)并未導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損。由此可見，盡管未導(dǎo)致局灶性的缺血性損傷，血管性癡呆模型中全腦缺血低灌注條件同樣可誘發(fā)室管膜下區(qū)內(nèi)源性細(xì)胞增殖及神經(jīng)元再生。研究發(fā)現(xiàn)，卒中導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡可介導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞分化再生為新生神經(jīng)元并遷徙至損傷部位修復(fù)受損的神經(jīng)元[12]。同時(shí)，室管膜下區(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞也可以分化再生為少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而修復(fù)髓鞘損傷[13]。因此，缺血低灌注所導(dǎo)致的以少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡及髓鞘脫失為特征性的腦白質(zhì)損傷可能是誘發(fā)室管膜下區(qū)細(xì)胞增殖增強(qiáng)的重要因素。

有研究認(rèn)為，缺血所激發(fā)的海馬齒狀回神經(jīng)再生是對(duì)短暫全腦缺血導(dǎo)致的海馬椎體神經(jīng)元死亡的一種反應(yīng)，而海馬齒狀回神經(jīng)再生與室管膜下區(qū)新生細(xì)胞的遷徙并不一致，其在缺血性損傷中可起獨(dú)立修復(fù)受損神經(jīng)元的作用[14]。海馬齒狀回神經(jīng)干/祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化可促進(jìn)脫髓鞘損傷的修復(fù)[15]。本研究對(duì)海馬齒狀回少突膠質(zhì)細(xì)胞再生不同階段的主要細(xì)胞進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，模型組少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞增多，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞減少，而成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞未見顯著差異，提示海馬齒狀回神經(jīng)干/祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞分化增加，但少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟障礙。有關(guān)血管性癡呆患者腦白質(zhì)的尸檢研究發(fā)現(xiàn)，腦白質(zhì)中少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞增多，而成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞卻顯著減少，這同樣提示了少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程可能受到了抑制[16-17]。鑒于在缺血性白質(zhì)損傷的修復(fù)過程中，少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞聚集于神經(jīng)元軸突周圍并向成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化是髓鞘修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。因此，盡管以少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡為特征的白質(zhì)損傷可通過釋放多種信號(hào)分子促進(jìn)內(nèi)源性髓鞘再生，從而發(fā)揮自我保護(hù)和修復(fù)作用，但由于少突膠質(zhì)細(xì)胞再生過程中被抑制，海馬新生的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞并不能進(jìn)一步分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)髓鞘損傷的作用。最新的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可通過促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞再生來改善缺血后的髓鞘損傷，有望成為未來血管性癡呆新的治療策略[19]。

本研究中，模型組海馬齒狀回新生星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著增多。既往研究認(rèn)為，在缺血性損傷下，血腦屏障破壞可引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性增生，釋放炎性因子參與缺血性炎癥反應(yīng)[20]。而另有研究認(rèn)為從起源上講，GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞可進(jìn)一步分化形成少突膠質(zhì)細(xì)胞從而參與髓鞘損傷的修復(fù)[13]。據(jù)此，我們推測(cè)，在該模型中由于海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞再生分化抑制，因而轉(zhuǎn)為分化為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增加。因此，本研究中新生反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的增多除了為缺血后的炎性增生外，同樣也可能為機(jī)體針對(duì)缺血性白質(zhì)脫髓鞘損傷所表現(xiàn)出的神經(jīng)再生被異常調(diào)控的結(jié)果，但目前尚缺乏海馬齒狀回GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)再生中作用的研究，相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究在血管性癡呆動(dòng)物模型水平證實(shí)了，反復(fù)缺血低灌注即可誘發(fā)室管膜下區(qū)顯著的細(xì)胞增殖及神經(jīng)元再生，海馬齒狀回的少突膠質(zhì)細(xì)胞再生障礙。其中少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生障礙可影響白質(zhì)髓鞘損傷的修復(fù)，這可能是血管性癡呆缺乏有效治療的原因之一。神經(jīng)干/祖細(xì)胞分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞，再分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制仍然不清，缺氧低灌注條件下細(xì)胞因子、酶及信號(hào)蛋白變化均可影響神經(jīng)再生的強(qiáng)度和方向[15，18-19]。這一系列的調(diào)節(jié)通路中可能存在影響血管性癡呆神經(jīng)再生修復(fù)的治療靶點(diǎn)，如何對(duì)可能的靶點(diǎn)進(jìn)行有效干預(yù)，從而促進(jìn)缺血低灌注條件下白質(zhì)損傷的修復(fù)，有待進(jìn)一步研究。

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