桃金娘組織培養(yǎng)初步研究

王尚顯，楊光穗，曾 淇，陳金花

（1.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南省熱帶觀賞植物種質創(chuàng)新利用工程技術研究中心，農業(yè)部華南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點開放實驗室，海南儋州571737；2.海南大學科技應用技術學院，海南儋州571737；3.海南省農業(yè)學校，海南?？?71100）

桃金娘組織培養(yǎng)初步研究

王尚顯1,2，楊光穗1，曾 淇3，陳金花1

（1.中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所，海南省熱帶觀賞植物種質創(chuàng)新利用工程技術研究中心，農業(yè)部華南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點開放實驗室，海南儋州571737；2.海南大學科技應用技術學院，海南儋州571737；3.海南省農業(yè)學校，海南?？?71100）

以桃金娘莖段、葉片、種子為外植體，研究0.1%H g C l2和2%N aC l O單獨消毒和組合消毒的消毒效果，探索出適合不同外植體消毒的有效方法和時間；并對最佳的誘導培養(yǎng)基和無菌系建立途徑進行篩選。實驗結果表明，組合消毒和消毒效率明顯優(yōu)于單一消毒劑消毒，其中單一消毒劑消毒時0.1%H g C l2的消毒效果又比2%N aC l O好；桃金娘莖段、嫩葉、老葉、果實的最佳消毒方式分別為：2%N aC l O浸泡10Mi n+0.1 %H g C l2浸泡8Mi n、2%N aC l O浸泡10Mi n+0.1%H g C l2浸泡6Mi n、0.1%H g C l2浸泡10Mi n+2%N aC l O浸泡8Mi n、0.1%H g C l2浸泡16Mi n。嫩葉較老葉和莖段更易誘導出愈傷組織，最佳的誘導培養(yǎng)基為2號培養(yǎng)基，愈傷組織誘導率達77.7%。無菌播種是桃金娘無菌系建立的最佳方式，萌發(fā)率高達75.0%。

桃金娘；組織培養(yǎng)；消毒

桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）是桃金娘科桃金娘屬植物，因其花色美麗、花期長，果實營養(yǎng)豐富，根又可入藥，是一種優(yōu)良的園林觀花灌木和治療風濕骨痛的藥材[1-2]。目前針對桃金娘的研究主要集中在藥用價值分析、加工利用、生態(tài)特性等方面，繁殖方法方面的研究少見報道，且僅限于播種繁殖和扦插繁殖。據(jù)現(xiàn)有報道，桃金娘扦插繁殖率極低，僅有5%左右，播種萌發(fā)率也僅有30%～40%[3-4]。目前桃金娘的利用主要依賴采集野生資源，而當前的繁殖手段無法滿足人類對其的需求，因此開展桃金娘快速繁育技術研究具有重要意義。

經過近一個多世紀的發(fā)展，組織培養(yǎng)技術已經成為一種成熟的繁殖手段，并應用在蝴蝶蘭、紅掌、龍血樹、竹芋等熱帶花卉的組織培養(yǎng)中。然而由于植物體的差異性，組培繁殖技術也存在一定的差異。特別在熱帶木本花卉的組培過程中常存在污染率和褐化率高，誘導率低的共性。為尋找一個桃金娘無菌體系建立的有效途徑，本研究以莖段、葉片、種子為外植體，研究不同消毒時間的消毒效果，并篩選出有效的誘導培養(yǎng)基，以期建立桃金娘無菌系，并為桃金娘繁育體系增加新的途徑，為桃金娘快速繁殖提供新的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為桃金娘莖段（頂芽下2～4節(jié)）、葉（嫩葉和老葉）、種子（5分熟、8分熟和全熟），取自中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所種質資源圃。

1.2 實驗方法

1.2.1 消毒方法 采取新鮮桃金娘的莖段（頂芽下2～4節(jié)）、葉片（嫩葉和老葉，下同）和種子（5分熟、8分熟和全熟，下同），用洗衣粉在自來水下清洗，轉至無菌工作臺用75%的酒精消毒2～3 s后，在用2%的次氯酸鈉（NaCl2O）、0.1%的生汞（HgCl2）中分別或依次進行消毒。消毒方法見表1。

表1不同外置體的消毒方法 （Min）

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 啟動培養(yǎng)基為添加不同濃度2,4-D、NAA、6-BA的MS培養(yǎng)基，見表2，附加蔗糖20 g/L、卡拉膠8 g/L，Ph值5.8。培養(yǎng)室溫度控制在25±2℃，光強3 000 lux，每天光照12 h。

表2培養(yǎng)基激素配方(mg/L)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

污染率=污染外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

褐化死亡率=褐化死亡外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

誘導存活率=誘導存活外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對莖段的消毒效果

不同消毒劑對莖段的消毒效率不同。在相同的消毒時間下，0.1%HgCl2的消毒效率明顯高于2%NaClO，但HgCl2對外植體的毒害作用也比較大，隨著消毒時間的延長，褐化死亡率明顯增加?？梢姡绻麊为毷褂?.1%HgCl2的消毒時間不宜超過20Min。從實驗結果看，組合消毒的消毒效率明顯優(yōu)于單一消毒劑消毒，其中最佳的消毒組合為2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡8Min，誘導存活率可達到44.4%（見圖1）。由于莖段表面有許多絨毛，加之莖段上腋芽部分不易消毒，所以莖段的平均污染率都比較高。

2.2 不同消毒方法對葉片的消毒效果

圖1 不同消毒方法對莖段消毒效率的影響（處理1：2%N aC l2O浸泡20Mi n；處理2：2%N aC l2O浸泡25Mi n；處理3：2% N aC l2O浸泡30Mi n；處理4：0.1%H g C l2浸泡20Mi n；處理5：0.1%H g C l2浸泡25Mi n；處理6：0.1%H g C l2浸泡30Mi n；處理7：2%N aC l2O浸泡10Mi n后再用0.1%H g C l2浸泡6Mi n；處理8：2%N aC l2O浸泡10Mi n后再用0.1%H g C l2浸泡8Mi n；處理9：2%N aC l2O浸泡10Mi n后再用0.1%H g C l2浸泡10Mi n。）

從圖2可知，嫩葉和老葉的組合消毒方法也明顯優(yōu)于單一消毒的方法，隨著消毒時間的延長，褐化死亡率總體呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，這是由于消毒劑的毒害作用所致。由于嫩葉攜帶的微生物較老葉的少、單寧等物質的含量較低，在相同的消毒方法和時間下，嫩葉的污染率和褐化率都比老葉的低，而誘導成活率都比老葉的高。嫩葉最佳消毒方法：2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡6Min；老葉最佳消毒方法為：2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡8Min。嫩葉比老葉更適合作為桃金娘組織培養(yǎng)的外植體材料。

2.3 不同浸泡方法對種子的浸泡效果

由于果實的果肉較厚，不同浸泡方法和時間對種子的浸泡效果無明顯差異，污染率均為0%，可選擇0.1%HgCl2浸泡16Min作為最佳的浸泡方法和時間。

2.4 不同培養(yǎng)基的誘導效果

2.2.1 莖段 1～3號培養(yǎng)基均不利于莖段從芽到芽的誘導。莖段培養(yǎng)18～20 d后即可觀察到白色致密的愈傷組織產生。其中2號培養(yǎng)基的愈傷組織的誘導時間最短，誘導率也最高，達41.3%；其次是3號培養(yǎng)基的誘導率為38.8%；1號培養(yǎng)基的誘導率最低，為27.7%（見圖3）。

圖2 不同消毒方法對葉片消毒效率的影響（處理10：老葉用0.1%H g C l2浸泡16Mi n；處理11：老葉用0.1%H g C l2浸泡20 Mi n；處理12：老葉用0.1%H g C l2浸泡24Mi n；處理13：老葉用2%N aC l O浸泡10 Mi n后0.1%H g C l2浸泡6Mi n；處理14：老葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1% H g C l2浸泡8Mi n；處理15：老葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1%H g C l2浸泡10 Mi n；處理16：嫩葉用0.1%H g C l2浸泡16Mi n；處理17：嫩葉用0.1%H g C l2浸泡20Mi n；處理18：嫩葉用0.1%H g C l2浸泡24Mi n；處理19：嫩葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1%H g C l2浸泡6Mi n；處理20：嫩葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1% H g C l2浸泡8Mi n；處理21：嫩葉用2%N aC l O浸泡10Mi n后0.1%H g C l2浸泡10Mi n)

圖3 莖段誘導出的愈傷組織

2.2.2 葉片 葉片誘導愈傷組織的時間短于莖段，培養(yǎng)15 d后即可觀察到愈傷組織的產生。從實驗結果看，以幼嫩的葉片在2號培養(yǎng)基中的誘導率最高，達77.7%（圖4）；其次是幼嫩葉片在1號培養(yǎng)基中的誘導效果，為66.6%；誘導率最低的是老葉在1號培養(yǎng)基中的誘導率，僅為11.1%。嫩葉在3種培養(yǎng)基中的誘導率均高于老葉；嫩葉和老葉在2號培養(yǎng)基中的誘導率均高于其他。

2.2.3 種子 種子播種后30 d開始萌發(fā)，沒有明顯的萌發(fā)高峰。不同培養(yǎng)基的誘導效果區(qū)別較大，成熟種子在1號培養(yǎng)基中的萌發(fā)率最高，為75%；其次是播種2號培養(yǎng)基中的5分熟的種子，而8分熟的種子總體萌發(fā)率都不高。種子萌發(fā)后發(fā)現(xiàn)在3號培養(yǎng)基中的植株生長較其他培養(yǎng)基中健壯（見表3、圖5）。

圖4 嫩葉誘導出的愈傷組織

表3 不同培養(yǎng)基條件下不同外植體的誘導率和萌發(fā)率 （%）

圖5 不同培養(yǎng)基條件下種子的萌發(fā)情況

3 討論

3.1 預處理和浸泡方法是無菌系建立的關鍵

植物組織培養(yǎng)過程中，無菌體系的建立是組織培養(yǎng)的關鍵，而采自大田的實驗材料極易粘附細菌和真菌等，建立無菌體系時不易浸泡，因此，必須根據(jù)材料幼嫩程度、材料類型等來決定浸泡方式和浸泡時間[5]。桃金娘屬熱帶植物，內生菌十分豐富，加之常年高溫多雨，空氣濕度大，在莖葉表面滋生大量的微生物，并附著大量的霉菌袍子和細菌芽飽，甚至一些菌絲體浸入表皮內的薄壁組織形成大量的內生菌，給外植體浸泡造成很大的困難[6]。桃金娘葉片和莖段的表面有許多絨毛，為外植體的浸泡增加了困難。

針對浸泡困難的外植體，單獨使用一種浸泡劑浸泡其污染率比較高，達不到理想的浸泡效果，而多種浸泡劑的配合使用已經在多種植物外植體的浸泡實驗中獲得成功。如：姚娜和賴志強[7]研究象草腋芽的外植體浸泡中發(fā)現(xiàn)其最佳浸泡措施為：自來水沖洗60Min+0.1%HgCl2浸泡25Min+2%NaClO浸泡20Min，該措施的污染率極低而且成活率最高。韓佳宇等[8]對石栗樹腋芽外植體浸泡研究表明最佳浸泡組合為：自來水沖洗120Min+0.1%HgCl2浸泡16Min+2%NaClO浸泡24Min，其組合的污染率最低達到了16.67%，而且愈傷組織誘導成功率最高達到了80.00%。陶興魁等[9]在研究藍莓外植體浸泡方法時發(fā)現(xiàn)用70%酒精30 s+2%NaClO浸泡10Min+0.1%HgCl2浸泡10Min的組合效果最好，其污染率最低，成活率最高。在本實驗中，采用了組合浸泡的方法在一定程度上提高了浸泡效率，降低污染率，莖段組合浸泡的存活率將單一0.1%HgCl2浸泡的9.2%提高到44.0%，即2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡8Min的組合浸泡方式。葉片組合浸泡即2%NaClO浸泡10Min后再用0.1%HgCl2浸泡 6 Min的存活率將單一 0.1% HgCl2浸泡最高的45.4%提高到77.7%。

除了通過組合浸泡的方式提高浸泡效率外，還可以通過選擇晴天采樣、采樣前移至室內培養(yǎng)或噴灑農藥、預處理時用農藥浸泡、培養(yǎng)基中添加抑菌劑等方式來提高浸泡效率。

3.2 無菌系建立的途徑

植株再生有器官發(fā)生型和體細胞胚胎發(fā)生型兩個途徑。不同植物種類誘導形成愈傷組織的敏感性和難易程度不同。外植體、培養(yǎng)基種類、激素配比、培養(yǎng)條件均會影響愈傷組織的誘導情況，常規(guī)來說，幼嫩的材料比成熟的材料更易進行愈傷組織誘導及其形態(tài)建成；同種的不同基因型個體在愈傷組織的誘導及其再生能力上又有差別；分生細胞和薄壁細胞較易誘導出愈傷[10]。本實驗中，葉片更比莖段容易誘導出愈傷組織。

如果采用無菌播種的方式，最佳的萌發(fā)率可達83%，極大地提高了種子萌發(fā)率，顯著高于直接田間播種30%～40%的萌發(fā)率[4]。未來可借鑒此種方法開展種子敞開式培養(yǎng)，即可提高萌發(fā)率又可打破無菌培養(yǎng)條件的局限性。相比葉片誘導愈傷組織途徑，無菌播種更具有無須經脫分化步驟，更易更快速地建立無菌系的優(yōu)點。

3.3 愈傷組織褐化的防止方法

當外植體組織被切割和接種時，受到損傷的細胞中酚類物質會被酚氧化酶氧化成有毒的醌類物質，這些物質擴散到培養(yǎng)基中抑制了其他酶活性，以至毒害整個外植體組織，組織變褐甚至死亡。研究者發(fā)現(xiàn)，影響組織褐化的因素有基因型、外植體的生理狀態(tài)、外植體種類和大小、培養(yǎng)基、防褐劑的使用和培養(yǎng)條件等[11-12]。一般來說褐變會隨著材料的年齡和組織木質化程度而增加；外植體越小，而切面與體積的比率越大，褐化程度越大；在有些植物中胚培養(yǎng)比葉片培養(yǎng)褐變少、莖尖比莖段褐變少等；培養(yǎng)基中高濃度糖、高含量氨態(tài)氮、低水平pH值等都會不同程度地增加褐化；強光照和高溫也會對褐化強度產生影響[11,13]。在黃金蒲桃的組織培養(yǎng)研究中，研究者發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基最適的pH值為6.0，冬季取材較夏季和春季取材好，WPM和Anderson培養(yǎng)基對芽誘導的影響差異不大，莖段的取材部位優(yōu)于頂芽[14]。研究者認為夏季取材時光照充足、溫度高，植物體內的酚類酶活性也較高，故污染率和褐化率都較高。根據(jù)前人的研究經驗，在后續(xù)的實驗中可使用低鹽、低糖培養(yǎng)基，并加入PVP、Vc等防褐劑，來減少外植體的褐化程度。

[1]陳火君,江曉燕.桃金娘開發(fā)應用研究進展[J].廣東農業(yè)科學,2007,（3）：109-111.

[2]趙志剛,程偉,郭俊杰.桃金娘的資源利用與人工培育[J].廣西林業(yè)科學,2006，35(2)∶70-72.

[3]楊治國.桃金娘扦插繁殖試驗初報[J].江西林業(yè)科技.2005，(2)：21-22.

[4]劉連海,代色平,賀漫媚.桃金娘繁殖與栽培技術初探[J].廣東林業(yè)科技,2013,29(2)∶49-52.

[5] Leifert C., Morris C. E., and Waitesc W.M.. Ecology of microbial saprophytes and pathogensin tissue culture and field-grown plants∶Reasons for contamination problems in vitro[J]. Critical Reviews in Plant Sciences. 1994,13(2)∶139-183.

[6]陳少珍,卜朝陽,閉志強,等.蘭花組織培養(yǎng)中常見問題及解決方法[J].廣西農業(yè)科學,2006,37(1)∶72-74.

[7] 姚娜,賴志強.象草腋芽外植體浸泡方法的篩選[J].基金組學與應用生物學,2010,29(5)∶943-946.

[8] 韓佳宇，歐克緯，禤維言，等.石栗樹腋芽外植體浸泡方法的篩選[J].南方農業(yè)學報，2012,43(8)∶1169-1172.

[9] 陶興魁,高貴珍,趙 亮,等.幾種方法對藍莓外植體浸泡的比較研究[J].淮北師范大學學報（自然科學版），2013，34(2)∶39-41.

[10]鄭成木，劉進平.熱帶亞熱帶植物微繁殖[M].長沙：湖南科學技術出版社，2001.13-39.

[11]周俊輝,周加絨,曾浩森,等.園藝植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及抗褐化研究進展[J].園藝學報，2000，27(增刊)∶481-486.

[12]赫英超,羅 磊,劉云宏，等.酶促褐變中酚類化合物代謝機理研究進展.農產品加工（學刊）,2013,316(5)∶55-58,66.

[13] Pindal A, Miczynski K. Regeneration of Cymbidium orchids from leaf and root explants[J]. Floria Horticulture, 1996，8(2)∶ 95-105.

[14]莫健斌,陳文燕,馬 斌,等.黃金蒲桃組織培養(yǎng)初步研究[J].江蘇林業(yè)科技,2013,40(5)∶10-13,29.

（責任編輯：張煥裕）

Primary Study on Tissue Culture of RhodoMytrus toMentosa

WANG Shang-xian1,2，YANGGuang-sui1，ZENGQi3，CHEN Jin-hua1
（1.Tropical Crops Genetic Resoures Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences&The Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental PlantGermplasMInnovation and Utilization,Hainan Province&Key Laboratory of Corp Gene Resources and GermplasMEnhancement in Southern China,Technical college of HaiNan University,Danzhou 571737,PRC;2.Institution of Technology,Hainan University,Danzhou 571737,PRC;3.Hainan Agriculture School,Haikou 571100,PRC）

Using stem,leaf,seed of Rhodomytrus tomentosa asexplants,the paperanalyzed the disinfection effectof 0.1%HgCl2and 2% NaClO alone and in combination,explored the effective explants disinfectionmethod and time for Rhodomytrus tomentosa explants,and screened the optimal approach for inducedmedium.The research results showed that:the combination disinfection effectwas better than alone disinfection,and that of 0.1%HgCl2better than 2%NaClO;the best disinfection method for stem,tender leaf,old leaf,fruit of Rhodomytrus tomentosa was 2%NaClO immersed 10 Min+0.1%HgCl2immersed 8 min,2%NaClO immersed 10 min+0.1%HgCl2immersed 6min,2%NaClO immersed 10min+0.1%HgCl2immersed 8Min,0.1%HgCl2immersed 16Min respectively.Tender leaf is more easily induced callus than old leaf and stem.The best inductionmediuMis no.2media.Young leaves of callus induction rate was 77.7%.Sowingunderaseptic condition is thebestway to clone Rhodomytrus tomentosa,and thegermination rate isashigh as75.0%.

Rhodomytrus tomentosa;tissue culture;disinfection

S723.132

A

1006-060X（2015）04-0074-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.04.024

2015-03-19

海南省重大科技項目（ZDZ X2013012）；海南省星火產業(yè)帶項目（H N X H201427）；海南省重點科技計劃項目（ZD X M201 20025）

王尚顯（1992-），男，海南臨高縣人，研究實習員，研究方向為觀賞園藝。

陳金花