響應(yīng)面法優(yōu)化忽地笑多糖提取工藝及石蒜屬植物多糖含量比較研究

劉小攀，田春蓮，姚姝鳳，董愛文，田啟建

吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實驗室，張家界 427000

多糖是由多個單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)，植物多糖是多糖的重要組成部分。大量的藥理與臨床研究證明，植物多糖具有抗腫瘤、防衰老、抗病毒、免疫、抗氧化、降血糖、降血脂等多種藥理作用，尤其是一種高效免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活免疫細(xì)胞而對正常細(xì)胞無毒副作用，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健品行業(yè)［1-8］。石蒜屬植物雖富含生物堿、多糖和及黃酮類化合物［9-11］，但目前研究熱點(diǎn)是石蒜生物堿及藥理活性［12］，石蒜多糖作為燃料酒精［13］有報道，多糖提取僅見于吳彥等［14］的研究，但未優(yōu)化工藝且提取率低。石蒜屬植物全世界約20 余種，我國有15 種，主要分布于長江以南，尤以溫暖地區(qū)種類較多［15］。湖南湘西地區(qū)石蒜屬植物主要有忽地笑［Lycoris aurea (L’Her.)Herb.］、中國石蒜(Lycoris chinensis Traub)、稻草石蒜(Lycoris straminea Lindl.)、石蒜［Lycoris radiata(L’Her.)Herb.］和玫瑰石蒜(Lycoris rosea Traub et Moldenke)等，其藥用價值未能得到深度開發(fā)。因此，本研究立足當(dāng)?shù)刭Y源，運(yùn)用響應(yīng)面分析軟件優(yōu)化了石蒜多糖傳統(tǒng)水提的工藝條件，并比較了忽地笑等五種石蒜屬植物的不同營養(yǎng)器官的多糖含量，旨在獲得石蒜多糖低成本、高得率的綠色提取工藝，篩選出高石蒜多糖含量的種質(zhì)資源，為綜合開發(fā)石蒜，進(jìn)一步提高石蒜深加工的附加值提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

忽地笑等實驗材料采自吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山石蒜栽培基地，經(jīng)吉首大學(xué)廖博儒研究員鑒定為石蒜科石蒜屬植物忽地笑、中國石蒜、稻草石蒜、石蒜及玫瑰石蒜。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號:130410-1)購自西隴化工股份有限公司;蒽酮、濃硫酸、無水乙醇和石油醚均為分析純;實驗用水為去離子水。

1.2 儀器

AEL-40SM 十萬分之一分析天平(日本島津公司);UV-3900 型紫外可見分光光度計(日本日立公司);數(shù)顯恒溫水浴箱(金壇市富華儀器有限公司);TDL-40B 低速臺式大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器)。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

分別將忽地笑、中國石蒜、稻草石蒜、石蒜和玫瑰石蒜的根莖葉洗凈，干燥，粉碎，過40 目篩，稱取一定量的各樣品加入一定量石油醚浸泡24 h，然后用一定量95%乙醇浸泡24 h，以除去其中的脂溶性物質(zhì)及部分色素，將殘渣45 ℃烘干，備用。

1.3.2 忽地笑多糖的提取

準(zhǔn)確稱取經(jīng)處理的忽地笑鱗莖粉末2.0 g 于50 mL 錐形瓶中，加入一定量的水，于一定溫度下水提，提取液4000 rpm 離心10 min，過濾，定容至100 mL，得忽地笑粗多糖溶液。根據(jù)蒽酮-硫酸法測定吸光度，計算忽地笑多糖含量。

1.3.2.1 單因素實驗設(shè)計

以忽地笑多糖得率為指標(biāo)，按照1.3.2 的方法，在一定條件下，分別考察液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 和30∶1(mL∶g);提取溫度55、65、75、85、95℃;提取時間3、4、5、6、7、8 h，對忽地笑多糖得率的影響。

1.3.2.2 響應(yīng)面實驗設(shè)計

為進(jìn)一步得出忽地笑多糖最佳提取工藝和綜合考察各因素的交互影響，在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 實驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗(表1)。以提取溫度(A)、液料比(B)、提取時間(C)為自變量，以忽地笑多糖得率為響應(yīng)值，通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件，對提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析。求出數(shù)學(xué)模型，得到最佳工藝參數(shù)。

表1 Box-Benhnken 實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照文獻(xiàn)［16］并改進(jìn)，稱取105 ℃真空干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖50 mg，用去離子水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，制成0.5 mg/mL 葡萄糖溶液。分別取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于50 mL 容量瓶中，去離子水定容至刻度。各取以上6 組溶液2 mL 于50 mL 錐形瓶中，冰水中加入0.2%的蒽酮-硫酸試劑(80%的濃硫酸)8 mL，搖勻，沸水浴10 min，冷卻至室溫，于625 nm 處測吸光度(A625)，以2 mL去離子為空白。以葡萄糖濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，得回歸方程A=9.285C +0.004，r=0.9995，在0.01～0.10 mg/mL 之間葡萄糖對照品濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.4 忽地笑多糖得率計算

采用蒽酮-硫酸法測定忽地笑中多糖的含量，根據(jù)實驗所得回歸方程A=9.285C+0.004，r=0.9995 計算樣品中多糖的含量，從而得到每個實驗組鱗莖中多糖得率，忽地笑多糖得率計算公式如下:

式中:C 為忽地笑粗多糖質(zhì)量濃度(mg/mL);X為稀釋倍數(shù);M 為忽地笑鱗莖粉末質(zhì)量/g;y 為忽地笑多糖得率/%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響

液料比是提取忽地笑多糖的一個很重要因素。結(jié)果如圖1(a)，液料比在10∶1～20∶1 (mL∶g)內(nèi)，多糖得率隨液料比的增加而上升，當(dāng)液料比達(dá)到20∶1(mL∶g)時多糖得率達(dá)到最高，之后隨液料比的增加多糖得率逐漸下降。這可能是由于隨著液料比的增加，多糖在水溶劑中逐漸達(dá)到飽和，再增大溶劑的體積，易提取出大量的雜質(zhì)而且不利于后續(xù)的處理。所以，選最佳液料比為20∶1(mL∶g)。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響

由圖1(b)可知，在55～75 ℃內(nèi)，隨著溫度的升高，多糖得率逐漸上升，75 ℃時達(dá)最大值，然后隨浸提溫度升高多糖得率逐漸降低，可能由于溫度過高導(dǎo)致多糖的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，故選取75 ℃為宜。

2.1.3 提取時間對多糖得率的影響

據(jù)圖1(c)所知，忽地笑多糖得率在3～7 h 內(nèi)隨提取時間延長而增加，7 h 時達(dá)最大，超過7 h 多糖得率急劇下降?？赡苡捎陔S著時間的延長，忽地笑粉末得到充分的浸泡而有利于多糖的溢出，超過一定時間后多糖發(fā)生水解而使提取率下降。因此，選取提取時間7 h。

圖1 液料比(a)、提取溫度(b)、提取時間(c)對忽地笑多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid/solid ratio (a)，extraction temperature (b)，extraction duration (c)on extraction yield of L.aurea polysaccharides

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗分析

通過Design-Expert 8.0.6.1 軟件對表2 中實驗結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，經(jīng)二次回歸擬合后得回歸方程:Y=42.01-0.50A +0.39B +0.29C-0.59AB-1.06AC-0.18BC-1.53 A2-0.44 B2-0.54 C2。

表2 Box-Benhnken 設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken design and experimental results

方差分析結(jié)果見表3。從表3 可知，較高的F值(45.53)和較低的P(＜0.0001)表明Quadratic 回歸方差模型極其顯著，模型的確定系數(shù)R2=0.9832，接近1，說明其因變量與全體自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著，真實值與預(yù)測值之間有很好的相關(guān)性，回歸方程能夠很好地模擬真實曲面，該實驗方法是可靠的。模型的調(diào)整系數(shù)=0.9616，這就意味著該模型能預(yù)測大部分(＞96%)多糖提取率的變化，只有不到4%不能通過該模型去解釋。因而該模型擬合程度良好，實驗誤差小。失擬項是用來評估方程可靠性的一個重要數(shù)據(jù)，本實驗失擬項F 值為1.77，P 值為0.2914＞0.05，說明該模型失擬項不顯著，能很好地預(yù)測相關(guān)的反應(yīng)。另外，實驗變異系數(shù)C.V.%越小表明實驗越可靠，本實驗的變異系數(shù)C.V.%為0.58，說明實驗值精密度高，可靠。因此，可用該模型方程來分析和預(yù)測不同提取條件下忽地笑多糖得率的變化。

P 值是用來檢測每個變量以及變量之間的顯著水平，P 值越小，說明變量對實驗的影響越顯著，由表3 可知A、B 和C 對忽地笑多糖得率都有顯著影響，且影響順序為:A＞B＞C;二次項A2、B2和C2對忽地笑多糖得率也有顯著影響，且A2對忽地笑多糖得率有極顯著影響(P＜0.0001)，交互項AB、AC也對得率有顯著影響，且AC 對忽地笑多糖得率也有極顯著影響(P＜0.0001)，BC 影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of the variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面及最優(yōu)化分析

3D 響應(yīng)面和2D 等高線是回歸方程的圖形化表示，它提供了實驗值與預(yù)測值的關(guān)系和各個變量之間的相互作用，圓形和橢圓形等高線表示各變量之間的顯著水平，圓形等高線表示相應(yīng)變量的交互作用不顯著，橢圓等高線表示相應(yīng)變量的交互作用顯著。本實驗的曲面圖和等高線圖見圖2。

圖2(a)說明在提取時間一定時，提取溫度和液料比對忽地笑多糖得率的作用，隨著液料比的增大，忽地笑多糖得率逐漸增大，而隨著提取溫度的升高多糖得率先上升后減少。圖2(b)表示液料比一定時，提取溫度和提取時間對忽地笑多糖得率的影響，提取時間一定時，多糖得率隨著提取溫度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，提取溫度一定時，多糖得率隨著時間的延長逐漸增大。由圖2(c)可知，在提取溫度一定時，在等高線圖中，等高線形狀接近圓形，說明B 和C 兩個因素交互作用不明顯，也就是對忽地笑多糖得率的影響不顯著。

圖2 各兩因素交互作用對忽地笑多糖得率影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the interactive effects of four extraction parameters on L.aurea polysaccharide yield

2.3 最佳工藝確定與驗證性實驗

根據(jù)所得到的模型，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行分析，得到在最佳提取溫度69.74 ℃、提取時間7.68 h、液料比23.30∶1(mL∶g)時，多糖的理論得率為42.37%。為了檢驗響應(yīng)面法的可行性，對回歸得到的最佳提取條件進(jìn)行驗證實驗，但是考慮到實驗操作的可行性與簡便性，將最優(yōu)提取條件該為:提取溫度70 ℃、提取時間7.7 h、液料比23∶1(mL∶g)、在此條件下進(jìn)行5 次平行實驗，忽地笑多糖的得率為42.00%，與預(yù)測值的相對誤差為0.87%。說明實驗值與預(yù)測值基本吻合。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化所得的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實用價值。

2.4 不同石蒜屬植物的不同形態(tài)學(xué)部位多糖含量比較

石蒜屬植物根、莖、葉等部位均含有多糖，但其含量在植物種類和組織器官間有顯著差異。如圖3所示，營養(yǎng)器官相比較，鱗莖最高，其次是根，葉中多糖含量最低，可能由于鱗莖為庫，葉片為源，同時，采集樣品是在2015年4 月初，而春出葉型的中國石蒜葉未成熟，導(dǎo)致含量最低;另一方面，多糖在五種石蒜屬植物間差異明顯，石蒜供試器官多糖含量均高于其他各種，尤其石蒜鱗莖中多糖最高可達(dá)49.21%;其次是稻草石蒜，除鱗莖和葉含量較高外，根中最高可達(dá)36.47%，相比之下，中國石蒜各器官多糖含量最低，可能因為中國石蒜由1000 m 以上的高海拔地區(qū)引入低海拔地區(qū)造成品種退化所致。因此，石蒜多糖提取適宜采用的石蒜屬植物為石蒜和稻草石蒜，除鱗莖作為提取材料外，根、葉也可采用，這樣對于充分利用石蒜屬植物資源，物盡其用具有重要意義。

圖3 不同石蒜屬植物多糖含量比較Fig.3 Comparison of polysaccharides contents in different Lycoris plant

3 結(jié)論

本實驗采用傳統(tǒng)的熱水提取忽地笑多糖，并比較了石蒜屬植物不同部位多糖含量，對石蒜屬多糖的后續(xù)開發(fā)和利用有較大的現(xiàn)實意義。探索了提取溫度、提取時間、和液料比對多糖得率的影響，經(jīng)單因素和響應(yīng)面實驗，得出熱水提取忽地笑多糖的最佳工藝為提取溫度70 ℃、提取時間7.7 h、液料比23∶1(mL∶g)，在此條件下得到的實際多糖提取率與預(yù)測值的相對誤差僅為0.87%，表明Box-Behnken 設(shè)計法用于石蒜多糖提取工藝的優(yōu)化篩選是可行的。

石蒜屬植物不同器官多糖含量分布有差異，以鱗莖中多糖含量明顯高于根與葉;就種間鱗莖多糖比較，石蒜鱗莖含量最高，可達(dá)49.21%。因此選用良種是首要環(huán)節(jié)，故選擇石蒜鱗莖進(jìn)行多糖提取，具有高效節(jié)能的效果。此研究可為合理開發(fā)利用石蒜源提供一定參考。

1 Zhao CJ，Li Z，Li CY，et al.Optimized extraction of polysaccharides from Taxus chinensis var.mairei fruits and its antitumor activity.Int J Biol Macromol，2015，75:192-198.

2 Li GF(李廣富)，Chen W(陳偉)，Li TT(李聽聽)，et al.Study on the anti-senile effect of Ganoderma lucidum polysaccharides probiotic yogurt.Food Ferment Ind(食品與發(fā)酵工業(yè))，2015，41(2):41-45.

3 Saha S，Navid MH，Bandyopadhyay SS，et al.Sulfated polysaccharides from Laminaria angustata:Structural features and in vitro antiviral activities.Carbohydr Polym，2012，87:123-130.

4 Wang XM(王雪梅)，Jia TY(賈天玉)，Guan B(管彬)，et al.Effects of Astragalus polysaccharide on CD4+CD25+Treg cell and Th17 cell in immunesuppressed mice.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2015，27:153-157.

5 Liu JL，Zheng SL，F(xiàn)an QJ，et al.Optimisation of high-pressure ultrasonic-assisted extraction and antioxidant capacity of polysaccharides from the rhizome of Ligusticum chuanxiong.Int J Biol Macromol，2015，76:80-85.

6 Dai R(代榮)，Liu RM(劉如明)，Xiao JH(肖建輝).Research progress on hypoglycemic effect and its mechanism of action of medicinal fungal polysaccharides.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2015，40:174-179.

7 Li MJ(李孟婕)，F(xiàn)an XP(范秀萍)，Wu HM(吳紅棉)，et al.Hypolipidemic effect of crude polysaccharides from Perna viridis.Food Sci(食品科學(xué))，2012，33:257-261.

8 Liu Q(劉齊)，Du P(杜萍)，Wang FS(王飛生)，et al.Study on ultrasonic extraction of polysaccharides in chestnut shell by response surface methodology.Sci Technol Food Ind(食品工業(yè)科技)，2014，35:221-223.

9 Wang H(王歡)，Wang YH(王躍虎)，Chen LJ(陳麗娟)，et al.Research progress of alkaliods from Lycoris.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:691-697.

10 Wu Y(吳彥)，Zhou SB(周守標(biāo))，Wan A(萬安).Analysis and comparison of polysaccharide content in Lycoris.Guihaia(廣西植物)，2005，25:264-268.

11 Yang Y(楊郁)，Huang SX(黃勝雄)，Zhao YM(趙毅民)，et al.Flavonoids from Lycoris aurea.Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2005，17:539-541.

12 Song DF(宋德芳)，Shi ZQ(石子琪)，Xin GZ(辛貴忠)，et al.Research advances in pharmacological effects of Amaryllidaceae alkaloids.Chin New Drug J(中國新藥雜志)，2013，22:1519-1524.

13 Yang X(楊鑫).The extraction of alkaloids and polysaccharide from Lycoris radiate and Study Their Relationships with The Ethanol Fermentation.Wuxi:Jiangnan University (江南大學(xué))，PhD.2011.

14 Wu Y(吳彥)，et al.The extraction technique of polysaccharide from Lycoris radiata.J Anqing Teachers Coll，Nat Sci(安慶師范學(xué)院學(xué)報，自科版)，2004，10(2):90-91.

15 Editorial Board of Flora China(中國科學(xué)院中國植物志編委會).Flora of China (中國植物志).Beijing:Science Press，1985.16，16.

16 Zhang H(張紅)，Wang T(王騰)，Li CQ(李翠清).Determination of polysaccharides from mulberry leaf by optimization of anthrone-sulfuric acid method by response surface methodology.Sci Technol Food Ind (食品工業(yè)科技)，2012，24:62-65.