正交試驗(yàn)優(yōu)選扶正生血膠囊提取工藝

鞠 楷，張 明，于波濤，范開(kāi)華，金偉華，譚永紅，陳 華

扶正生血膠囊是依據(jù)我院老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方研發(fā)的中藥新藥，由補(bǔ)骨脂、鹿茸、虎杖等中藥材組成，具有滋陰培陽(yáng)，益腎健脾，扶正固本，補(bǔ)氣益血的功效，可用于腫瘤放化療后的支持治療，亦可用于再生障礙性貧血、失血性貧血及其他不明原因引起的全血細(xì)胞減少等癥。 其原劑型為煎劑，為方便患者使用，我院將其研究開(kāi)發(fā)制成膠囊劑。 在保證制劑質(zhì)量的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)處方中藥物的化學(xué)成分及理化性質(zhì)，結(jié)合處方的功能主治，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選該制劑的提取工藝[1-3]，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀 （四元泵、G1314B VWD 檢 測(cè) 器、Agilent Eclipse XDB-C18分析柱， 美國(guó)安捷倫公司）；AL204 電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；101-2B 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)。

1.2 試劑 白藜蘆醇對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121028-200909)。 中藥飲片均購(gòu)于成都市益誠(chéng)藥業(yè)有限公司，經(jīng)本院中藥房主任藥師曹均告鑒定符合《中國(guó)藥典》2010 年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。水為三重蒸餾水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 干膏得率的測(cè)定 按處方比例稱取扶正生血膠囊中的藥材一定量，加入適量的水，于一定時(shí)間煎煮一定次數(shù)，濾過(guò)，濃縮，蒸干，稱定干膏重量，干膏得率=干膏重量/每份藥材質(zhì)量×100%[4]。

2.2 白藜蘆醇的含量測(cè)定

2.2.1 色譜 條件 色 譜 柱：Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水（23：77）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm；進(jìn)樣量：20μl。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品7.2 mg，置于100 ml 棕色量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為72 μg/ml 的白藜蘆醇對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取2.1 項(xiàng)下研細(xì)的干膏粉末0.3 g，精密加入50%乙醇30 ml，稱重，超聲30 min，放冷稱重，用50%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例制成缺虎杖的陰性樣品， 按2.2.3 項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液、 供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μl， 按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。 結(jié)果顯示，陰性對(duì)照溶液在與白藜蘆醇對(duì)照品相應(yīng)出峰處未見(jiàn)吸收峰，表明陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 扶正生血膠囊色譜圖

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別精密量取白藜蘆醇對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、10 ml，置于10 ml 量瓶中，加50%乙醇定容， 制成濃度分別為7.2、14.4、21.6、28.8、36.0、72.0 μg/ml 的對(duì)照品溶液。 分別精密吸取20 μl 注入色譜儀， 按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。 以對(duì)照品濃度X 為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=6146X+160.15（r= 0.9992）。 結(jié)果表明，白藜蘆醇在7.2 ～72.0 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，RSD 為2.18%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品， 精密稱取6份，分別按2.2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。 結(jié)果，RSD=2.33%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批樣品的供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD=2.60%（n=6），表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)選 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按處方稱取藥材9 份(每組試驗(yàn)平行操作3 次)， 每份重983 g，采用L9(34)正交試驗(yàn)法對(duì)水煎煮提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。 以白藜蘆醇含量和干膏得率為指標(biāo)，考察加水倍數(shù)(A)、煎煮時(shí)間(B)、煎煮次數(shù)(C)對(duì)提取工藝的影響。 因素水平見(jiàn)表1。

表1 提取工藝正交設(shè)計(jì)表因素水平

2.4 水煎煮工藝正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。 應(yīng)用SPSS16. 0 進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3、4。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以白藜蘆醇含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)， 各因素對(duì)提取工藝的影響程度依次為C＞A＞B，每個(gè)因素的水平主次為C3＞C2＞C1、A1＞A2＞A3、B1＞B2＞B3。 由此可見(jiàn)，最佳提取工藝為A1B1C3，即加10倍量水，煎煮3 次，每次120 min；以干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)， 各因素對(duì)提取工藝的影響程度依次為C＞A＞B， 每個(gè)因素的水平主次為C3＞C2＞C1、A1＞A2＞A3。 方差分析因素A、C 有顯著影響，因素B 影響不顯著。 由此可見(jiàn)，最佳提取工藝為A1B3C3，即加10倍量水煎煮3 次，每次60 min。 由于白藜蘆醇的抗菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗血栓、抗氧化、抗自由基以及抗癌、抗誘變[5-7]等作用在本處方功效中有很重要的影響，所以，本實(shí)驗(yàn)提取工藝最優(yōu)選擇以白藜蘆醇的含量為主要導(dǎo)向，即以工藝A1B1C3為最佳。 不過(guò)從表2、3 可以看出，B 因素各水平間差異較小，所以，從節(jié)能、 節(jié)時(shí)的角度考慮， 確定最佳提取工藝為A1B2C3，即加10 倍量水煎煮3 次，每次90 min。

表2 水煎煮工藝正交試驗(yàn)安排及結(jié)果

表3 白藜蘆醇含量正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表4 干膏得率正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.5 工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方稱取藥材共3 份，按最佳提取工藝A1B2C3提取，分別測(cè)定干膏中白藜蘆醇含量及干膏得率，3 次平行試驗(yàn)結(jié)果分別為：白藜蘆醇含量：0.4909 mg/g、0.4985 mg/g、0.5169 mg/g；干膏得率：30.32%、29.80%、31.61%。 白藜蘆醇含量和干膏得率的RSD 分別為0.89%，1.02%。 驗(yàn)證結(jié)果表明，按最佳提取工藝A1B2C3所得的白藜蘆醇含量及干膏得率都超過(guò)正交試驗(yàn)中的最大值，可以認(rèn)為該工藝提取較完全，且其白藜蘆醇含量和干膏得率均較穩(wěn)定，說(shuō)明該工藝可行。

3 討論

在對(duì)虎杖的有效成分白藜蘆醇提取溶劑的選擇上，筆者先參照藥典中虎杖的提取方法選用稀乙醇提取，但此條件下的白藜蘆醇峰形不好。 后參考王磊等[8]建立的虎杖商品藥材中白藜蘆醇苷的含量測(cè)定方法中溶劑的最佳濃度，最終確定用50%乙醇作為溶劑，測(cè)得的白藜蘆醇峰形好，分離度好。

筆者采用正交試驗(yàn)，擬定加水倍數(shù)、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)3 個(gè)因素對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)選， 結(jié)果表明：無(wú)論以白藜蘆醇含量，還是干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)， 煎煮次數(shù)都是影響最大的， 故最終選擇煎煮3次有利于有效成分盡可能溶出。 其次，加水倍數(shù)也有較大影響，呈現(xiàn)出有效成分溶出隨加水倍數(shù)增大而增加的趨勢(shì)，故最終選擇加10 倍量水。最后，在3個(gè)因素中，煎煮時(shí)間影響最小，但90 min 和120 min相比于60 min 有效成分溶出還是有所增長(zhǎng)， 故最終以節(jié)能、節(jié)時(shí)為考慮選擇煎煮時(shí)間為90 min。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)和工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了最佳提取工藝，在該工藝條件下，白藜蘆醇含量和干膏得率均較穩(wěn)定， 且都超過(guò)正交試驗(yàn)中的最大值，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了專業(yè)的理論依據(jù)。

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