雌激素受體β 過表達對三陰乳腺癌細胞生物學行為的影響

鄭少峰 黃貴和 羅澤斌 黃楚君 劉瑞磊

乳腺癌是一種高度異質性的腫瘤，Perou 和Sorlie 等［1-2］根據分子表型將乳腺癌分為5 類:Lumina1 A、Luminal B、Normal Breast Like、C - erB -2(HER2)及Basal - like 乳腺癌。這幾類乳腺癌在分子生物學特征、組織形態(tài)、免疫表型還是對治療的反應上都存在著極大的差異?；虮磉_譜芯片檢測發(fā)現，Basal-like 乳腺的表達譜特征為ER、PR 和HER2 這三種受體基因表達缺失，p53 表達，BRCA1 和P53 基因突變，而EGFR、Ki -67 和cyclin D 等細胞增殖相關基因表達上調［3］，因此臨床上將ER、PR 和HER2 表達陰性的這類乳腺癌稱為三陰乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer，TNBC)。

TNBC 的臨床特征為原發(fā)腫瘤體積大，臨床分期晚，組織形態(tài)學特點為腫瘤細胞增殖活性高和侵襲能力強。與其它類型的乳腺癌相比，TNBC 遠處轉移率高，易轉移至肺臟和肝臟等內臟器官［4］。由于TNBC 缺乏內分泌治療及針對HER2的分子靶向治療的相應靶點，治療手段較為匱乏，預后生存較非TNBC 差［5］，成為乳腺癌治療中的難點。

雌激素在雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)陽性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，ER 的表達狀況對判斷乳腺癌預后及指導乳腺癌的內分泌治療具有重要意義。ERα 作為經典的ER，通常認為其陽性表達者預后較好，1997 年成功地克隆鑒定了第二個雌激素受體:ERβ 后，關于ERβ 對乳腺癌的作用和在內分泌治療中的地位成為了新的研究熱點。

多個實驗證實在多數ERα 陰性和三陰乳腺癌患者中仍有ERβ 表達。ERβ 與遠處轉移減少相關，是ERα 陰性乳腺癌的獨立預后因素。在某些腫瘤的體外細胞實驗中，ERβ 過表達已被證實能抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡。那么ERβ對TNBC 細胞的增殖和凋亡是否存在影響呢?本研究將選用ERβ 低表達的TNBC 細胞株MDA -MB -435s，采用脂質體轉染，建立ERβ 穩(wěn)定高表達的細胞株。觀察ERβ 對TNBC細胞增殖凋亡以及侵襲轉移能力的影響。以探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 經患者知情同意，隨機選取中山大學附屬第三醫(yī)院2007 年1 月～2014 年10 月病理證實為TNBC行乳腺癌手術治療的手術標本60 例，并取癌旁正常乳腺組織標本60 例，年齡33 ～69 歲，中位年齡51.0 歲，患者全部為女性。

1.1. 2 細胞 人乳腺癌細胞系MDA -MB -435s 購自美國典型細胞培養(yǎng)庫(ATCC)。

1.1. 3 試劑 鼠抗人ERβ 單克隆抗體購自Abcome 公司，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone 公司，胰蛋白酶購自GIBCO 公司，Western blot 用兔抗人多克隆抗B -actin 抗體、羊抗兔和兔抗鼠二抗購自中杉金橋生物技術有限公司，限制性核酸內切酶(BamH I 和Hind III)、T4 DNA 連接酶、dNTP等購自Fermentas 公司，DNA 回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，脂質體Lipofectamine 2000TM及Trizol 購自Invitrogen 公司，G418 等化學試劑購自Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測ERβ 在TNBC 患者腫瘤及癌旁組織中的表達 取經福爾馬林固定、石蠟包埋的蠟塊，4 μm 連續(xù)切片，烤片2 h 后經二甲苯連續(xù)脫蠟三次。梯度酒精水化。EDTA 抗原修復后滴加3%過氧化氫，阻斷內源性過氧化物酶。PBS 漂洗后加一抗孵育過夜(4 ℃)，PBS 漂洗后加二抗，室溫下孵育45 min，DAB 室溫下顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。ERβ 陽性染色定位于細胞核。隨機計數5 個高倍視野，按陽性率=陽性細胞數÷癌細胞總數×100%計算每個高倍視野中陽性細胞所占比例，取其平均值為該張切片的表達水平。ERβ 陽性細胞＞25%者記為為陽性，見圖1A，≤25%計為陰性，見圖1B。

圖1 ERβ 在TNBC 中的表達

1.2.2 pEGFP-C1/ERβ 真核表達載體的構建 以Trizol 試劑法提取ERβ 陽性表達的人乳腺癌細胞株MCF - 7 總RNA。以總RNA 為模板，Oligo(dT)為引物，將mRNA 反轉錄為cDNA，利用ERβ 引物(分別引入限制性內切酶BamH I和Hind III 酶切位點)擴增出ERβ 序列。上游引物5' -GATGCTTTGGTTTGGGTGAT - 3'，下游引物5' - CTTGTTACTCGCATGCCT-3'。以限制性內切酶BamH I 和Hind III消化PCR 產物，DNA 回收試劑盒回收目的片段，將ERβDNA片段插入經相同限制性內切酶消化、回收的真核表達載體pEGFP-C1。連接產物轉化E. coli DH5α 擴增后，提取細菌中的質粒，酶切鑒定后送華大基因公司測序。成功構建真核表達載體pEGFP-C1 -ERβ。

1.2.3 pEGFP-C1/ERβ 質粒轉染、篩選及鑒定 取對數生長期人乳腺癌細胞株MDA-MB-435s 以2 ×105個/孔接種于6 孔板，以正常MDA - MB -435s 細胞為對照，按Lipofectamine2000TM操作說明書，分別轉染pEGFP-C1 (空質粒)和pEGFP-C1 -ERβ。4 ～6 h 后，棄去轉染液，更換2 mL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后以750 mg/L 的G418 的培養(yǎng)液進行篩選，約16 d 后對照MDA -MB -435s細胞全部死亡，轉染組改用200 mg/L 的G418 的培養(yǎng)液，將陽性克隆擴大培養(yǎng)后，建立穩(wěn)定傳代的轉染細胞系。

1.2.4 Western-blotting 法鑒定ERβ 在轉染細胞中的表達

收集MDA-MB -435s -pEGFP -C1 -ERβ 細胞蛋白，將50 μg 樣本加在8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠孔中，80 V 電壓電泳跑膠，110 mA 電流轉膜。轉膜后用脫脂奶粉封閉2 h(室溫)，洗膜后加入ERβ 單克隆抗體(1∶300)和β - actin(1∶500)，4 ℃條件下孵育過夜，復溫并洗滌后二抗孵育1 h(室溫)，用化學發(fā)光試劑盒Thermo 進行曝光，電泳凝膠成像分析儀采集圖像。

1.2.5 MTT 法檢測細胞活性 將MDA-MB -435s、MDA -MB -435s -pEGFP -C1、MDA -MB -435s -pEGFP -C1 -ERβ 細胞以2 ×104個/孔的密度接種于96 孔板中，在恒溫37 ℃、飽和濕度、5%CO2的條件下培養(yǎng)，設5 個平行孔。分別于第1 ～7 天加入100 μL 5 mg/mL 甲基噻唑基四唑(MTT)工作液，孵育4 h 后棄去上清，加入100 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶解MTT 還原物，震蕩15 min，用酶聯免疫儀檢測波長為490 nm 處的吸光度數值，實驗重復3 次，取均值。以時間為橫坐標，A490值為縱坐標，繪制曲線，評估細胞增殖情況。

1.3 Transwell 侵襲實驗

在Transwell 小室上室面加入50 μL 按比例混合的Matrigel 與DMEM 培養(yǎng)基，置于37 ℃凝固。取對數生長期的MDA-MB-435s -pEGFP -C1 和MDA -MB -435s -pEGFP-C1 -ERβ 細胞計數后，加入含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，配成2 ×105/mL 的細胞懸液，上室每孔加入100 μL 細胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出小室，用棉簽拭去Matrigel 膠。95%甲醇室溫下固定20 min，風干，0.25%結晶紫染色，風干后，置于顯微鏡下計數并拍照。

1.4 軟瓊脂集落形成實驗

按1∶1 比例將0.7% 瓊脂與2 ×DMEM 培養(yǎng)液按混合，加入對數生長期的MDA -MB -435s -pEGFP -C1 和MDA-MB-435s-pEGFP-C1 -ERβ 細胞懸液，充分混勻，制成密度為2 ×103/mL 的混懸液，每孔1 mL 注入到含0.6%瓊脂的六孔板中，瓊脂凝固后，將六孔板置于恒溫37 ℃、飽和濕度、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 w。用0. 2% 的p-iodonitrotetrazolium violet 染色后置于顯微鏡下觀察集落形成并拍照。

2 結果

2.1 ERβ 在TNBC 患者腫瘤及癌旁組織中的表達

60 例TNBC 組織標本中，ERβ 陽性表達的為23 例(38.33%)，對應60 例癌旁組織中ERβ 陽性表達的為31 例(51.67%)，顯著高于癌組織中的陽性表達率。

2.2 穩(wěn)定高表達ERβ 細胞株的篩選及鑒定

用脂質體的方法轉染ERβ 至人乳腺癌細胞株MDA -MB-435s 中，經G418 篩選，并通過Western blotting 進行鑒定。以親代細胞MDA - MB - 435s 和轉染空載體的細胞MDA-MB-435s -pEGFP -C1 作為對照。獲得ERβ 蛋白高表達克隆，見圖2。

圖2 穩(wěn)定轉染ERβ 基因的MDA-MB-435s 細胞中ERβ 表達量增高

2.3 ERβ 抑制TNBC 細胞的生長

通過MTT 法繪制三組細胞生長曲線以觀察ERβ 對細胞增殖的影響。與MDA-MB-435s 細胞及轉染空質粒的細胞MDA-MB -435s -pEGFP -C1 相比，轉染ERβ 的MDA -MB-435s 細胞其生長速度下降，見圖3。

2.4 ERβ 對TNBC 細胞侵襲能力的影響

通過計數穿過微孔膜的細胞數量來衡量細胞的侵襲能力。與轉染空載體的細胞相比，轉染ERβ 的MDA -MB -435s 細胞穿過transwell 微孔膜的細胞數量明顯下降，細胞的侵襲能力明顯降低，見圖4。

圖3 ERβ 的表達對MDA-MB-435s 細胞增殖能力的影響

圖4 ERβ 的表達對MDA-MB-435s 細胞侵襲能力的影響

2.5 ERβ 對TNBC 細胞成瘤能力的影響

軟瓊脂集落形成實驗顯示，與轉染空載體的細胞相比，轉染ERβ 的MDA-MB-435s 細胞形成的集落明顯減少，說明ERβ 可抑制TNBC 細胞的錨定非依賴性生長能力。

3 討論

TNBC 好發(fā)于30 ～40 歲的絕經前婦女、體質量指數較高的絕經前婦女、腰臀比較高的圍絕經期女性，以及有乳癌家族史或BRCA1 基因突變失活的女性［6-8］。TNBC 的治療目前仍主要依靠化療，由于大多數TNBC 存在BRCA1 基因的突變，而體外研究證實鉑類藥物、絲裂霉素、依托泊苷和博來霉素等對BRCA1 基因突變的乳腺癌敏感［9］，所以有學者認為大劑量化療能給TNBC 患者帶來更大的生存獲益［10］。在分子靶向治療方面，現有的研究發(fā)現PARP(一種DNA 修復酶)可能是TNBC 新的治療靶點，而其它靶向藥物如貝伐單抗(Bevacizumab，Avastin)西妥昔單抗(Cetuximab)等僅有小范圍的臨床試驗［11-12］結果并不令人滿意?，F在針對TNBC的化療藥物和靶向治療藥物還無法在大樣本、前瞻性、多中心臨床試驗中得到驗證，同時還存在著副作用大或價格昂貴等缺點，因此，尋找潛在有效的治療靶點，解決TNBC 治療效果不佳的難點，具有重要的意義。

人類ERβ 基因位于染色體14q23 -24.1，由530 個氨基酸構成［13］。ERα 和ERβ 通常在大多數正常乳腺組織、乳腺癌和乳腺癌細胞株中共同表達，但某些乳腺癌細胞只表達ERβ，也有乳腺癌細胞兩種受體都不表達［14］。ERβ 在許多ERα 陰性和TNBC 細胞中表達，提示ERβ 在雌激素信號通路和三陰乳腺癌的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。但是其表達水平的高低對TNBC 細胞增殖和凋亡的影響還沒有定論，與相關生理病理指標的關系以及它在臨床內分泌治療中的地位還有很多不一致的結果。在非乳腺癌腫瘤中的研究發(fā)現ERβ 是一個重要的抑癌因子，在腫瘤細胞中表達明顯減少［15］。ER除了通過與雌激素結合這種配體依賴性的方式調節(jié)轉錄翻譯外，還可以在無雌激素作用時以配體非依賴性方式調節(jié)轉錄翻譯［16］。在乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中也觀察到ERβ以雌激素非依賴的方式抑制腫瘤細胞增殖或誘導凋亡［17-19］。可見應用各種ERβ 受體激動劑或小干攏RNA 來研究ERβ 受體的作用，明確它所涉及的有關下游機制，在治療TNBC 的研究中具有很大的價值。

本研究采用免疫組化法檢測ERβ 在TNBC 及癌旁組織中的表達情況，并分析其在兩種組織中的表達差異，以及ERβ 高表達對TNBC 細胞的增殖、侵襲、錨定非依賴性生長能力的影響，研究表明，ERβ 過表達后，TNBC 細胞MDA -MB-435s 的增殖能力明顯下降，同時，穿膜能力和錨定非依賴性生長能力均大幅度下降。以上研究結果表明，ERβ 的高表達可對TNBC 細胞增殖、侵襲及遷移起到抑制作用，在TNBC 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，為TNBC 的基因治療提供了可靠的實驗依據。

綜上所述，ERβ 的表達與TNBC 的發(fā)生發(fā)展密切相關，其表達缺失可能是TNBC 癌變過程中的早期事件。隨著對其功能研究的進一步完善，ERβ 必將成為診斷和預測TNBC預后的分子標志物和抗TNBC 侵襲和轉移的生物治療新靶點，為TNBC 的治療提供新的突破口。

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