速熟腐乳生產(chǎn)中腐乳成分及微觀結(jié)構(gòu)的分析

汪建明，張 燕，于水淼，賀 樂(lè)，李立英

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

腐乳作為大豆的一種發(fā)酵制品，富含蛋白質(zhì)以及亞油酸、油酸等不飽和脂肪酸，不含膽固醇等[1].發(fā)酵成熟的腐乳具有營(yíng)養(yǎng)較豐富、質(zhì)構(gòu)較細(xì)膩柔滑、滋味鮮美和誘人食欲的特點(diǎn)，是人們喜愛(ài)的開胃佐餐食品和調(diào)味品.在歐美，腐乳因其質(zhì)構(gòu)類似軟質(zhì)干酪而被稱為“Chinese-cheese”[2].

傳統(tǒng)腐乳的后酵過(guò)程是形成其特殊質(zhì)地和風(fēng)味的關(guān)鍵，但是后期成熟周期較長(zhǎng)，一般情況下要經(jīng)過(guò)4～6 個(gè)月，腐乳的色、香、味才能達(dá)到品質(zhì)要求，使得工廠的生產(chǎn)效率偏低，經(jīng)濟(jì)成本偏高.因此，在添加一定酶制劑促進(jìn)蛋白質(zhì)和脂肪酶解的基礎(chǔ)上，采用添加乳酸菌混合菌種發(fā)酵劑發(fā)酵、產(chǎn)酸實(shí)現(xiàn)凝乳，從而得到的速熟腐乳，既可以改善傳統(tǒng)腐乳產(chǎn)品發(fā)酵周期長(zhǎng)的問(wèn)題，同時(shí)可提高生產(chǎn)效率.

腐乳的質(zhì)量評(píng)價(jià)通常是通過(guò)感官評(píng)定來(lái)確定，但是感官評(píng)定的重現(xiàn)性不佳，所以不能作為唯一的評(píng)價(jià)指標(biāo).氨基態(tài)氮含量和蛋白質(zhì)水解度可以作為評(píng)價(jià)腐乳成熟程度的指標(biāo)之一，二者呈正相關(guān)性.聚丙烯酰胺-凝膠電泳(SDS-PAGE)是分離腐乳蛋白成分并確定其相對(duì)分子質(zhì)量的有效方法，這種方法基于蛋白質(zhì)或肽的物理性質(zhì)進(jìn)行分離[3-5].腐乳質(zhì)構(gòu)主要指腐乳內(nèi)在的性質(zhì)，如彈性、黏性、硬度、脆性.此外，水分含量也影響腐乳的質(zhì)地.利用掃描電鏡可以對(duì)腐乳進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察.

本文研究了利用乳酸菌混合發(fā)酵劑生產(chǎn)速熟腐乳在成熟過(guò)程中的理化指標(biāo)、感官品質(zhì)、蛋白質(zhì)水解度、質(zhì)構(gòu)特性以及微觀結(jié)構(gòu)變化，并與市售腐乳進(jìn)行對(duì)比.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

大豆，市售；MT-53X(乳酸菌、乳脂乳球菌、嗜熱鏈球菌)發(fā)酵劑、Accelerzyme CPG、Piccantase A，荷蘭DSM 公司；利民市售腐乳，天津市利民調(diào)料有限公司；王致和市售腐乳，北京王致和食品集團(tuán)有限公司.

1.1.2 主要試劑

甲醛，中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司；硝酸銀，上?；瘜W(xué)試劑廠；鉻酸鉀，北京化學(xué)試劑公司；丙烯酰胺，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷，北京化工廠；過(guò)硫酸銨，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；β-巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250，Amresco 化學(xué)試劑公司；甘氨酸，天津市化學(xué)試劑一廠；十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)，加拿大BBI 公司.

1.1.3 主要設(shè)備

FE-20 型pH 計(jì)、AB204-N 型電子分析天平，梅特勒托利多儀器有限公司；SU1510 型掃描電鏡，日本電子株式會(huì)社(JEOL)；JY-SP-BT 型電泳槽、JY-600 型電泳儀，北京六一電泳設(shè)備有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、冷凍干燥機(jī)，Thermo 電子公司；臺(tái)式恒溫振蕩培養(yǎng)箱，北京沃德創(chuàng)意技貿(mào)有限責(zé)任公司；HWS260 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TA-XT 質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro Systems公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

速熟腐乳的制作流程如圖1 所示.

圖1 速熟腐乳的制作流程圖Fig.1 Flow chart of making instant-sufu

1.2.2 樣品的制備[6-7]

豆?jié){：大豆500,g，液料比(mL∶g)為1∶3，24.5,℃浸泡9,h，磨漿水溫61,℃.

白坯：豆?jié){(固形物含量8%)，酶制劑(m(CPG)∶m(A)＝2∶1)添加量為1.5,mg/L，發(fā)酵劑的添加量為0.2,mL/L，培養(yǎng)溫度為30,℃，培養(yǎng)時(shí)間為6,h，氯化鈣的添加量為0.2,g/L，將白坯切成3.0,cm×3.0,cm×3.0,cm 的豆腐塊備用.

毛坯：在制成的白坯豆腐塊上噴灑毛霉孢子，在28,℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40,h.

腐乳：將經(jīng)酶解的毛坯在75～80,℃條件下保持30,min，再將經(jīng)滅酶的毛坯放在湯料中，進(jìn)行后酵貯藏.

1.2.3 腐乳的感官評(píng)定

按照DB,52/525—2007[8]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與細(xì)則見(jiàn)表1.

表1 腐乳的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Sensory evaluation rules of sufu

1.2.4 測(cè)量方法

水分含量的測(cè)定采用直接干燥法[9].

總酸含量(乳酸)的測(cè)定采用酸堿中和滴定(酸度計(jì))法[10].

氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定采用甲醛滴定法[11-12].

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏微量定氮法[13].

NaCl 含量的測(cè)定采用硝酸銀滴定法[14]，并稍作改進(jìn)：精確稱取10,g 樣品，加入90,mL 蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，在電爐上燒開后冷卻，定容至100,mL.精確吸取5,mL，隨后加入25,mL 蒸餾水，加入10 滴鉻酸鉀指示劑，用0.1,mol/L 硝酸銀滴至磚紅色為終點(diǎn)，記錄消耗硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積.同時(shí)進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)，計(jì)錄空白滴定消耗硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積.NaCl含量的計(jì)算公式為

式中：V 為消耗硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V0為空白滴定時(shí)，消耗硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c 為硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；NaCl 的摩爾質(zhì)量為0.058 44,kg/mol；m 為樣品的質(zhì)量，g.

1.2.5 SDS-PAGE 電泳的測(cè)定

A 液(丙烯酰胺儲(chǔ)存液)：稱取29.2,g 丙烯酰胺和0.8,g 雙丙烯酰胺，加蒸餾水至100,mL，4,℃冰箱保存.

B 液(4#分離膠緩沖液)：將75,mL 2,mol/L 的Tris-HCl(pH 8.8)、4,mL 10% SDS、21,mL 蒸餾水混勻，4,℃冰箱保存.

C 液(4#濃縮膠緩沖液)：將50,mL 1,mol/L 的Tris-HCl(pH 6.8)、4,mL 10% SDS、46,mL 蒸餾水混勻，4,℃冰箱保存.

電泳緩沖液：稱取3,g Tris、14.4,g 甘氨酸、1,g SDS，加蒸餾水至1,L.

上樣緩沖液：含有 2,mL 0.5,mol/L Tris-HCl(pH,6.8)，2,mL 甘油，2,mL 10% SDS，0.5,mL 0.1%溴酚藍(lán)，1.0,mL 2-β-巰基乙醇，2.5,mL 雙蒸水，室溫保存.

分離膠的配制(15%，20,mL)：10,mL A 液，5,mL B 液，0.1,mL 10%過(guò)硫酸銨，10,μL TEMED，0.5,mL蒸餾水，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配.

濃縮膠的配制(5%，8,mL)：1.34,mL A 液，2,mL C 液，60,μL 10%過(guò)硫酸銨，10,μL TEMED，4.6,mL 蒸餾水，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配.

染色液：0.2,g 考馬斯亮藍(lán)R-250，84,mL 95%乙醇，20,mL 冰乙酸，定容到200,mL 并過(guò)濾，室溫保存.

脫色液：乙醇、冰乙酸、蒸餾水的體積比為9∶1∶10.

取0.05,g 樣品，加入100,μL 去離子水，室溫振蕩2,h，10,000,r/min 離心5,min，取上清液備用.取上清液加入上樣緩沖液，煮沸5,min，8,000,r/min 離心5,min.用微量進(jìn)樣器將處理好的樣品緩慢均勻加入加樣孔中.濃縮膠上所加的電壓是80,V，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，將電壓提高至120,V.電泳結(jié)束后，凝膠在固定液中固定1,h，染色5,h 后脫色，直到蛋白質(zhì)背景干凈，藍(lán)色條帶清晰為止.最后用凝膠成像儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集并分析[15].

1.2.6 質(zhì)構(gòu)分析

質(zhì)構(gòu)分析是采用壓縮方式測(cè)試食品的觸覺(jué)特性.觸覺(jué)特性影響到消費(fèi)者的感官感覺(jué)和對(duì)食品的接受程度[16].選取探頭類型為P/0.5，測(cè)前速度為3.00,mm/s，測(cè)中速度為 1.50,mm/s，測(cè)后速度為1.50,mm/s，2 次下壓間隔時(shí)間為10.00,s，下壓距離為10.00,mm.

測(cè)定的質(zhì)構(gòu)參數(shù)包括硬度、彈性、內(nèi)聚性、黏性、咀嚼度和回復(fù)性，各參數(shù)的定義見(jiàn)表2[17].

表2 質(zhì)構(gòu)參數(shù)的含義Tab.2 Definition of texture parameters

1.2.7 微觀結(jié)構(gòu)觀測(cè)

取待測(cè)樣品切成薄片，使其表面保持平整，浸泡于2.5%的戊二醛溶液中，置在4,℃條件下固定3,h 以上.然后，用pH,7.2 的磷酸緩沖液清洗3 次，每次保持10,min.分別用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇梯度脫水10,min 左右.再將樣品放置在冷凍干燥器下迅速冷凍，然后進(jìn)行捶擊，使之自然斷裂，選擇小塊樣品.采用離子濺射方法噴金約5,min，最后置于掃描電鏡下進(jìn)行觀察[18-19].

2 結(jié)果與討論

2.1 感官品質(zhì)評(píng)價(jià)

對(duì)速熟腐乳進(jìn)行感官指標(biāo)的測(cè)定，并與市售的利民腐乳和王致和腐乳進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 速熟腐乳與傳統(tǒng)腐乳的感官評(píng)價(jià)分析比較Tab.3 Sensory evaluation of instant-sufu and traditional sufu

由表3 可以看出：速熟腐乳在色澤、口感和香氣等方面與市售的腐乳沒(méi)有顯著差異.

2.2 理化指標(biāo)分析

將發(fā)酵30,d 的速熟腐乳與市售的利民腐乳和王致和腐乳進(jìn)行比較，3種腐乳的理化指標(biāo)對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表4.

由表4 可以看出：速熟腐乳的水分含量、總酸含量、氨基酸態(tài)氮和蛋白質(zhì)含量與市售的利民腐乳和王致和腐乳沒(méi)有顯著的差異，均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；速熟腐乳的NaCl 含量明顯低于市售的兩種腐乳，且略低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，這更加符合人們對(duì)低鹽食品的需求，同時(shí)也改變了腐乳只能作為調(diào)料品的觀念，其可作為輔餐食用.

表4 速熟腐乳與傳統(tǒng)腐乳的理化指標(biāo)比較Tab.4 Index comparison of instant-sufu and traditional sufu

2.3 SDS-PAGE電泳分析

分別取白坯、毛坯、后酵10,d，后酵20,d、速熟腐乳(后酵30,d)、利民腐乳、王致和腐乳進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)，并采用凝膠呈像系統(tǒng)軟件，通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)比分析乳酸菌發(fā)酵豆乳凝膠樣品中蛋白質(zhì)的水解情況，結(jié)果見(jiàn)圖2.

圖2 樣品的SDS凝膠電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of the sample

由圖2 可以看出：白坯中大豆蛋白主要由7,S 和11,S 球蛋白構(gòu)成，7,S 主要由α′、α、β 三個(gè)亞基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量分別為76,000、72,000、50,000，而11,S由酸性亞基(相對(duì)分子質(zhì)量為 30,000～40,000)和堿性亞基(相對(duì)分子質(zhì)量在25,000 以下)構(gòu)成.在乳酸菌發(fā)酵豆乳凝膠過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，大分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)被水解成小分子質(zhì)量的胨、肽和氨基酸，球蛋白的水解程度也增加，7,S 和11,S 球蛋白的亞基被水解，表現(xiàn)為條帶變窄，說(shuō)明出現(xiàn)了大量的小分子質(zhì)量物質(zhì).在11,S 堿性亞基以下的小分子的快速遷移中肽隨時(shí)間逐漸增多，最終該新型的速熟腐乳后酵30,d 所得到的腐乳與市售成熟6 月的腐乳出現(xiàn)條帶的寬窄相似，表明速熟腐乳的成熟程度與市售腐乳一致.

2.4 質(zhì)構(gòu)分析

利用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)白坯、發(fā)酵10,d、發(fā)酵20,d 和速熟腐乳(后酵30,d)樣品進(jìn)行質(zhì)構(gòu)參數(shù)測(cè)定，并與利民腐乳和王致和腐乳進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表5.

由表5 可以看出：速熟腐乳的硬度隨著發(fā)酵的延長(zhǎng)不斷地變小，與市售的利民腐乳相差不大，但卻明顯高于市售王致和腐乳，這可能是因?yàn)樵谕踔潞透樵谥谱鬟^(guò)程中水分含量較高；速熟腐乳的彈性、黏性、咀嚼度和回復(fù)性隨著發(fā)酵時(shí)間的推后，均呈現(xiàn)小幅度下降的趨勢(shì)，且與市售腐乳的指標(biāo)相差不大，比較適中.

表5 樣品的質(zhì)構(gòu)參數(shù)測(cè)量結(jié)果比較Tab.5 Comparison of texture and structure

2.5 微觀結(jié)構(gòu)觀測(cè)

對(duì)白坯、速熟腐乳(后酵30,d)及市售的腐乳的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行電鏡掃描實(shí)驗(yàn)，對(duì)比其微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 樣品的微觀結(jié)構(gòu)對(duì)比Fig.3 Comparison of the microstructure of the samples

豆?jié){中由于水化膜和雙電層的存在，使得蛋白質(zhì)粒子均勻穩(wěn)定地溶解于水中，而豆腐白坯則是借助乳酸菌產(chǎn)酸和鈣橋的作用使得大豆蛋白相互聯(lián)結(jié)，形成致密穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，如圖3(a)所示.由于毛坯的水解作用，腐乳內(nèi)部大的膠粒狀蛋白質(zhì)聚集體被降解成小聚集體，隨著后酵時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)膠粒逐漸變小，當(dāng)速熟腐乳的后酵時(shí)間達(dá)到30,d 時(shí)，坯體中膠粒蛋白質(zhì)消失，蛋白質(zhì)已經(jīng)完全被水解，形成平滑均一的形態(tài)，如圖3(b)所示.速熟腐乳與市售腐乳對(duì)比發(fā)現(xiàn)，速熟腐乳的微觀結(jié)構(gòu)與市售6 月的腐乳結(jié)構(gòu)較相似，其形態(tài)較市售腐乳平滑均一，說(shuō)明后酵30,d 的腐乳已達(dá)到成熟.

3 結(jié)語(yǔ)

本文將經(jīng)乳酸菌混合發(fā)酵劑發(fā)酵得到的速熟腐乳與市售兩種腐乳進(jìn)行了對(duì)比.分析表明，在感官指標(biāo)、電泳分析、質(zhì)構(gòu)分析、微觀結(jié)構(gòu)和理化指標(biāo)中除NaCl 含量外，速熟腐乳與市售的利民腐乳和王致和腐乳間無(wú)明顯差異，且符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).速熟腐乳的發(fā)酵生產(chǎn)周期顯著縮短，并且其NaCl 含量明顯低于市售腐乳，可作為輔餐使用，具有較好的開發(fā)前景.

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