RP-HPLC 法同時(shí)測(cè)定頤腦解郁顆粒中梔子苷和五味子醇甲

趙衛(wèi)云 ，孫耀志，高 松，楊 玲，王瑞娜，馮德文

1河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;2 河南省宛西制藥股份有限公司研發(fā)部，鄭州 450000

頤腦解郁顆粒來(lái)源于北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院唐啟盛教授的驗(yàn)方，本方由梔子、五味子、郁金、刺五加四味中藥組成。具有益腎調(diào)氣、解郁安神的作用，在臨床上常用于腎精不足，肝氣郁滯所致抑郁癥者。方中梔子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜的作用［1］，環(huán)烯醚萜類化合物是梔子中的主要活性成分，其所含的梔子苷可作為本顆粒質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。五味子中含有的多種木脂素成分被認(rèn)為是五味子中最主要的藥理活性成分，其所含的五味子醇甲具有廣泛的中樞抑制作用和神經(jīng)保護(hù)作用［2，3］。采用HPLC 法單獨(dú)測(cè)定梔子苷、五味子醇甲的文獻(xiàn)已有報(bào)道［4-8］，但在同一色譜條件下實(shí)現(xiàn)這2 種組分同時(shí)測(cè)定的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，可一次進(jìn)樣同時(shí)檢測(cè)上述2 種成分，檢測(cè)效率高，且精密度、穩(wěn)定性等方法學(xué)考察均符合要求，可為頤腦解郁顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供可靠的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);AL104 電子天平和MS105 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

梔子苷對(duì)照品(批號(hào):0749-200007)、五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):110857-201211)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;頤腦解郁顆粒(批號(hào):20130301、20130401、20130501)為宛西制藥研發(fā)部自制;甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～12 min，30% A;12～20 min，30%～60% A;20～40 min 60%A)，體積流量1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm(0～20 min)，250 nm(20～40 min)。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取梔子苷與五味子醇甲對(duì)照品適量，置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻配置1 mL 含梔子苷0.1432 mg、五味子醇甲0.0513 mg 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按頤腦解郁顆粒的處方比例和制備工藝，分別制備缺梔子和缺五味子的陰性制劑，按2.2.2 項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。陰性對(duì)照色譜圖中，在與供試品及對(duì)照品色譜圖中相應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)、頤腦解郁顆粒供試品(B)、缺五味子陰性樣品(C)及缺梔子陰性樣品(D)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards (A)，Yinao Jieyu Granules (B)，negative sample without Schisandrae Chinensis Fructus (C)and negative sample without Gardeniae Fructus (D)

2.3.2 線性關(guān)系考察

分別精密吸取2.2.1 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、12、16、20 μL，依次進(jìn)樣，按照2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:梔子苷Y=1469.71X+74.39;相關(guān)系數(shù)r=0.9997。表明梔子苷的含量在0.2864～2.8640 μg 之間，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。五味子醇甲Y=2077.52X +7.21;相關(guān)系數(shù)r=0.9999。表明五味子醇甲的含量在0.1062～1.0620 μg 之間，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，梔子苷、五味子醇甲峰面積RSD分別為1.16%、1.35%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，梔子苷、五味子醇甲峰面積RSD 分別為1.64%、1.82%。表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按2.2.2 項(xiàng)供試品溶液的制備方法平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定梔子苷、五味子醇甲的峰面積，計(jì)算得梔子苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.50 mg/g，RSD 為1.36%，五味子醇甲的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.84 mg/g，RSD 為1.62%。表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含有量的樣品0.5 g，平行6 份，精密稱定，分別精密加入梔子苷和五味子醇甲混合對(duì)照品溶液(含梔子苷0.4242 mg/mL 和五味子醇甲0.1401 mg/mL)10 mL，按2.2.2 項(xiàng)供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Results of recovery tests (n=6)

2.4 樣品測(cè)定

取3 批樣品，分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備樣品溶液，照2.1 項(xiàng)下條件測(cè)定，計(jì)算供試品中梔子苷和五味子醇甲的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 Contents of jasminoidin and schisandrae detected in 3 batches of samples (n=3)

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

頤腦解郁顆粒中梔子苷和五味子醇甲這2 種指標(biāo)成分的最大吸收波長(zhǎng)不同，通過(guò)紫外全波長(zhǎng)掃描的光譜圖可知，梔子苷在238 nm 處有最大吸收，五味子醇甲在250 nm 處有最大吸收。試驗(yàn)中曾考察用同一個(gè)波長(zhǎng)測(cè)定這兩個(gè)指標(biāo)成分，發(fā)現(xiàn)分離效果不是很好，故選擇雙波長(zhǎng)法，使這兩個(gè)指標(biāo)成分在各自最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定，以獲得最佳的檢測(cè)效果。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同溶劑系統(tǒng)，如乙腈-水、甲醇-水對(duì)色譜峰分離效果的影響。結(jié)果表明以不同比例的乙腈-水為流動(dòng)相的分離效果不是很理想，以甲醇-水進(jìn)行梯度洗脫，可將待測(cè)組分完全分離，縮短分析時(shí)間。故選擇甲醇-水作為流動(dòng)相。

3.3 提取條件的選擇

試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)供試品溶液的處理方法進(jìn)行了考察，首先采用超聲提取和回流提取這兩種方法進(jìn)行考察。結(jié)果表明:兩種提取方法的提取效率比較接近，但超聲提取方法操作簡(jiǎn)便、快捷，故本實(shí)驗(yàn)確定以超聲處理作為提取方法。又分別采用甲醇、乙醇、水這三種不同的溶劑超聲提取，并對(duì)不同提取時(shí)間進(jìn)行比較試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中將樣品分別超聲20、30、40 min 后測(cè)定梔子苷和五味子醇甲的含量。結(jié)果表明，用甲醇作溶劑，超聲30 min 處理樣品為最佳，可使樣品中的梔子苷和五味子醇甲提取完全。

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