基于近紅外光譜法的枳實(shí)含量測定

雷敬衛(wèi)，樊明月，2，白 雁*，謝彩俠，張迪文

1河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046;2 新鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院，新鄉(xiāng) 453002

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙C.sinensis Osbeck 的干燥幼果，5～6 月果實(shí)自落后采集，除去雜質(zhì)，從中部橫切為兩半，低溫干燥或曬干。枳實(shí)味苦、辛、酸，溫，歸脾、胃、大腸經(jīng)，辛行苦降，破氣除痞，消積導(dǎo)滯，化痰，是中醫(yī)上常用的中藥之一。2010 版《中國藥典》對枳實(shí)的質(zhì)量控制做出了明確的規(guī)定，其辛弗林的含量不得少于0.30%，醇浸出物不得少于12.0%。由于枳實(shí)中辛弗林、醇浸出物含量的高低影響枳實(shí)藥材的質(zhì)量，故控制其兩者的含量對評價枳實(shí)質(zhì)量有重要的意義。雖然HPLC、熱浸法測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，其過程費(fèi)時費(fèi)力，難以滿足制藥過程中對原藥材的快速檢測。

近紅外光譜分析技術(shù)作為一種快速無損的綠色分析技術(shù)，具有快速分析樣品、處理簡單、無需試劑消耗等特點(diǎn)［1，2］，目前已用于藥效成分的含量測定［3］、中藥純化過程分析［4］、天然藥物鑒別［5，6］和藥材的快速模式識別［7，8］等。這種快速分析檢測技術(shù)是最有希望應(yīng)用于中藥的工業(yè)化生產(chǎn)中。本研究以枳實(shí)為研究對象，采用近紅外漫反射光譜技術(shù)結(jié)合PLS 建立了枳實(shí)中辛弗林、醇浸出物的定量分析模型，為大批量枳實(shí)的含量測定提供一種新的方法，同時也為枳實(shí)的快速評價與在線檢測提供參考和依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 樣品來源

101 份枳實(shí)藥材由河南某藥廠提供，由河南中醫(yī)學(xué)院董誠明教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.栽培變種的干燥幼果。

1.2 儀器

Nicolet 6700 型傅立葉變換近紅外光譜儀(配有InGaAs 檢測器、外接積分球、樣品旋轉(zhuǎn)器、OMNIC 光譜采集軟件和TQ Analyst8 分析軟件，美國Thermo Nicolet 公司)，Agilent1200 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)，AE240 十萬分之一精密天平、AL204 型分析天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)，KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q Academic A10 超純水機(jī)(美國Millipore 公司)，F(xiàn)W-100 高速萬能粉碎機(jī)、101-3AB電熱鼓風(fēng)干燥箱、DZKW-4 電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。

1.3 試劑

辛弗林對照品(批號:110727-201107)購自中國食品藥品檢定研究院，甲醇(色譜純，TEDIA)，甲醇(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，磷酸二氫鉀、十二烷基磺酸鈉、冰乙酸(天津市登科化學(xué)試劑有限公司)，無水乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，聚酰胺(浙江省臺州市路橋四甲生化塑料出品)，超純水，蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 近紅外光譜的采集

取上述101 份樣品適量，粉碎，過65 目篩，取約5 g 粉末裝入石英杯，混合均勻，依以下條件進(jìn)行掃描，采集光譜圖。測樣方式:積分球漫反射;分辨率8 cm-1;掃描次數(shù)64 次;掃描范圍12000～4000 cm-1;溫度25～30℃;相對濕度25%～35%。每個樣品重復(fù)掃描3 次，計(jì)算平均光譜以建立模型，101份樣品的近紅外光譜疊加圖見圖1。

圖1 101 份枳實(shí)的NIR 原始光譜疊加圖Fig.1 Overlaid NIRS spectra of 101 C.aurantium samples

由圖1 可知每份樣品的近紅外原始圖譜基本一致，且譜帶相互重疊，僅單單根據(jù)此圖無法確定枳實(shí)中各指標(biāo)性成分的含量與吸光度之間的相關(guān)性，故必須通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立其定量分析模型，才能確定枳實(shí)中各指標(biāo)性成分的含量與其近紅外光譜圖之間的關(guān)系。

2.2 參考值的測定

2.2.1 辛弗林的含量測定

按照2010 年版《中國藥典》一部中枳實(shí)項(xiàng)下辛弗林的HPLC 含量測定方法進(jìn)行測定。取枳實(shí)粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足，濾過，精密量取10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 溶解，通過聚酰胺柱(2.5 g，內(nèi)徑1.5 cm)，用水25 mL 洗脫，收集洗脫液，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

色譜條件:Diamonsil ? C18(5 μm，4.6 mm ×200 mm)色譜柱，以甲醇:磷酸二氫鉀溶液(磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，稀釋至1000 mL)50∶50 為流動相，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm。每份樣品平行測定兩次，計(jì)算平均值，并以其作為參考值。以干燥品計(jì)算供試品中辛弗林的含量(%)，101 份樣品的辛弗林含量為0.33%～0.56%。結(jié)果見表1。

表1 枳實(shí)中辛弗林的含量測定結(jié)果Table 1 Content determination results of synephrine in C.aurantium

2.2.2 醇浸出物的含量測定

按照2010 年版《中國藥典》一部附錄X A 項(xiàng)下的醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定。用70%乙醇作為溶劑，對枳實(shí)中的醇浸出物進(jìn)行測定。取枳實(shí)粉末約2 g，精密稱定，置100 mL 的錐形瓶中，精密加70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h 后，加熱回流至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，再稱定重量，用70 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量。以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)，101 份樣品的醇浸出物含量為9.99%～13.22%。結(jié)果見表2。

表2 枳實(shí)中醇浸出物的含量測定結(jié)果Table 2 Content determination results of ethanol-extract in C.aurantium

2.3 模型的建立與驗(yàn)證

根據(jù)枳實(shí)中辛弗林、醇浸出物含量的分布范圍，將101 份樣品分為校正集和驗(yàn)證集，驗(yàn)證集樣品各指標(biāo)含量范圍處于校正集樣品含量范圍之內(nèi)。表3為校正集和驗(yàn)證集樣品辛弗林、醇浸出物含量的分布范圍。

表3 校正集和驗(yàn)證集辛弗林、醇浸出物含量分布范圍Table 3 Sample distribution of calibration set and validation set

2.3.1 模型的建立

建模時所選回歸方法的不同，對模型的準(zhǔn)確性有較大的影響。常用的回歸方法有CLS(經(jīng)典的最小二乘法)、SMLR(逐步多元線性回歸法)、PLS(偏最小二乘法)、PCR(主成分回歸法)等。每一種方法均有各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，而對于組成復(fù)雜的天然產(chǎn)物如中藥、煙草等通常使用PLS。必須對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，常用的預(yù)處理方法有多元散射校正法(MSC)，標(biāo)準(zhǔn)歸一化法(SNV)，一階導(dǎo)數(shù)法(First derivative)，二階導(dǎo)數(shù)法(Second derivative)等。

表4 不同回歸方法對R2 和PI 的影響Table 4 The influence of different regression methods on R2 and PI

建模時所選的光譜區(qū)間不僅包含待測組分的信息量，同時也包含了少部分的冗余信息以及噪聲干擾。所以在建立模型時需要不斷選擇特征波段以調(diào)整模型的準(zhǔn)確性。

用PLS 法建立近紅外定量模型時，主成分?jǐn)?shù)的選擇對模型的優(yōu)劣有顯著影響。主成分?jǐn)?shù)太多，使模型包含過多的冗余信息與噪音，出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象;主成分?jǐn)?shù)過少，導(dǎo)致建模信息不全，預(yù)測能力差［9］。

通過回歸方法的選擇，對光譜預(yù)處理與模型優(yōu)化，辛弗林、醇浸出物的建模參數(shù)及評價指標(biāo)見表5，辛弗林、醇浸出物的定量分析模型見圖2。

表5 辛弗林及醇浸出物的建模參數(shù)及評價指標(biāo)Table 5 Modeling parameters and evaluation index of synephrine and ethanol-extract

圖2 辛弗林(A)及醇浸出物(B)的定量分析模型圖Fig.2 Quantitative models of synephrine (A)and ethanol-extract (B)

2.3.2 模型的驗(yàn)證

運(yùn)用所建定量分析模型對預(yù)測樣品進(jìn)行定量分析，從而驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。辛弗林、醇浸出物的RMSEP 分別為0.0119、0.188，相關(guān)系數(shù)r 分別為0.9106、0.9484，各指標(biāo)參考值與預(yù)測值相關(guān)圖見圖3。

圖3 辛弗林參考值(A)和醇浸出物參考值(B)與預(yù)測值相關(guān)圖Fig.3 Correlation plots of predicted values and reference values of synephrine and ethanol-extract

從各指標(biāo)定量分析模型圖及參考值與預(yù)測值相關(guān)圖可以看出，枳實(shí)近紅外光譜與其辛弗林及醇浸出物含量之間存在一定的相關(guān)性，NIR 預(yù)測值較準(zhǔn)確接近藥典法測定的參考值，建立的NIR 定量分析模型具有較好的預(yù)測效果，可快速預(yù)測其覆蓋范圍內(nèi)枳實(shí)中辛弗林、醇浸出物的含量。

3 討論

本試驗(yàn)與廠家合作，利用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合PLS 建立了枳實(shí)中辛弗林、醇浸出物的定量分析模型，該方法分析速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、無損害、無化學(xué)污染等優(yōu)點(diǎn)恰恰彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分析方法的不足，可用于廠家在枳實(shí)原藥材的質(zhì)量控制中的快速、批量檢測。同時，該方法對其他中藥及有效成分的質(zhì)量分析也具有一定的借鑒意義。

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