牛糞中纖維素降解菌的分離鑒定及其產(chǎn)酶研究

汪學(xué)軍，閔長莉，韓彭磊，張麗君

1皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院;2 皖西學(xué)院大別山植物內(nèi)生菌資源研究中心，六安 237012

近年來，隨著我國畜牧業(yè)規(guī)?；图s化的迅速發(fā)展，畜禽糞便的產(chǎn)生量也大大增加，已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物的主要生產(chǎn)源。研究發(fā)現(xiàn)，畜禽糞便中富含有機(jī)質(zhì)和氮、磷、鉀等元素，可以成為再利用的資源［1］，但是由于畜禽糞便中纖維素與木質(zhì)素含量高且難以分解利用而被丟棄，從而成為污染源造成環(huán)境的污染及資源的浪費(fèi)［2-4］。因此，如何合理的處理和利用這些畜禽糞便，在不造成環(huán)境污染的情況下，又將其轉(zhuǎn)化為可再生性的資源已成為目前研究的熱點(diǎn)，國內(nèi)外學(xué)者對于微生物能分解轉(zhuǎn)化纖維素的有關(guān)研究相當(dāng)重視［5，6］。從蚯蚓養(yǎng)殖場泥土中分離篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)菌株，研究發(fā)現(xiàn)氨化預(yù)處理可提高該菌株對玉米秸稈的降解率，經(jīng)鑒定其屬于枯草芽孢桿菌［7］。楊瑩等從牛糞自然堆肥中分離篩選出2 株降解纖維素能力較強(qiáng)的菌株，初步鑒定其均為曲霉屬真菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩株真菌可作為降解畜禽糞便發(fā)酵劑的優(yōu)良生產(chǎn)菌株，且棉粕是較為理想的固體發(fā)酵氮源［8］。許玉林等用剛果紅染色法從甘蔗地土壤中分離得到一株具有較強(qiáng)纖維素降解能力的真菌，經(jīng)鑒定該菌株屬于草酸青霉，其對天然的濾紙降解率較高，在3 d 內(nèi)對濾紙的降解率為32.95%［9］。高云航等從新鮮牛糞樣品中篩選得到1 株產(chǎn)酶活較高的纖維素分解菌，經(jīng)鑒定其為短小芽孢桿菌，產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果表明，該菌株以0.5%玉米粉為碳源、1%酵母粉為氮源、初始pH 3.0、42 ℃搖瓶培養(yǎng)54 h 產(chǎn)酶活最高［10］。由此可見，若將這些纖維素分解菌應(yīng)用于畜禽廢棄物進(jìn)行無害化處理，可為解決環(huán)境污染與資源浪費(fèi)等問題提供一條可行的途徑。

目前，對于纖維素分解菌選育應(yīng)用研究較多的是真菌與細(xì)菌，尤以曲霉、木霉和青霉為典型，而對放線菌的研究報道較少。本實(shí)驗(yàn)從新鮮牛糞樣品中分離篩選出一株具有較強(qiáng)纖維素分解能力的菌株NF38，通過生理生化特征研究、形態(tài)學(xué)和16S rDNA生物學(xué)手段對其分類鑒定，并對菌株NF38 產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究，以期為纖維素分解菌株的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛糞樣品

六安市億牛乳業(yè)荷斯坦奶牛的新鮮糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體富集培養(yǎng)基(g/L):選擇羧甲基纖維素鈉為唯一碳源的培養(yǎng)基配方，即CMC-Na 10、FeSO4·7H2O 0.001、K2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、NaNO30.5、硫酸鏈霉素0.02;pH 7.2［11］。分離培養(yǎng)基(g/L):CMC-Na 10.0、FeSO4·7H2O 0.001、K2HPO41.0、MgSO4·7H2O 0.5、KCl 0.5、NaNO30.5、瓊脂粉15.0;pH 7.2。純化培養(yǎng)基:高氏Ⅰ號固體培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基:高氏Ⅰ號液體培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):CMC-Na 10、酵母浸出粉3.5、MgSO4·7H2O 0.5、輕質(zhì)CaCO36.0、KH2PO40.1，pH 自然。

1.2 纖維素降解菌株的篩選

新鮮牛糞樣品10 g 加入到裝有90 mL 液體富集培養(yǎng)基的錐形瓶中進(jìn)行富集培養(yǎng)，30 ℃震蕩培養(yǎng)7 d。取富集后的培養(yǎng)液10 mL 接種至90 mL 液體富集培養(yǎng)基中，再次在同樣的條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。取后一次的富集培養(yǎng)液1 mL 按10 倍濃度梯度依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5;分別取稀釋10-3、10-4、10-5富集液0.1 mL 至分離培養(yǎng)基平板上涂布均勻后，靜置30 min 后，倒置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。采用劃線法對分離平板上的放線菌菌株在純化培養(yǎng)基平板上進(jìn)行純化至菌落純的放線菌，對純化得到菌株編號和保藏。

取上述純化得到的放線菌菌株分別點(diǎn)種于分離培養(yǎng)基平板中央，30 ℃培養(yǎng)7 d 后，在每個培養(yǎng)平板中倒入0.1%的剛果紅顯色液15 mL，靜置10 min倒去顯色液，并用去離子水漂洗平板表面2～3 次，觀察有無水解圈，并對菌落直徑d 和水解圈直徑D進(jìn)行測量和記錄。

1.3 菌株NF38 酶活力的測定

菌株NF38 接種到種子培養(yǎng)液中于30 ℃、150 rpm 震蕩培養(yǎng)48 h 后，按5%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d。收獲的發(fā)酵液經(jīng)10000 rpm離心5 min，所得到取上清即為粗酶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

在潔凈的試管中加入1 mL 粗酶液和1.5 mL 的1% CMC-Na 磷酸緩沖液或者濾紙作為底物，在50℃水浴鍋中保溫30 min，然后迅速加入2.5 mL DNS并搖勻，使反應(yīng)終止，沸水浴5 min，快速冷卻后在波長為540 nm 下測定OD 值，分別測得測定纖維素酶酶活(CMCA)和濾紙酶酶活(FPA)［12］。酶活單位(IU)按國際單位定義為:1 mL 酶液1 min 產(chǎn)生1 mol 還原糖的酶量作為1 個酶活單位［12］。

1.4 菌株NF38 鑒定

1.4.1 菌株NF38 形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征研究

在直徑為90 mm 的培養(yǎng)平板上以劃線法接種菌株NF38，培養(yǎng)后觀察菌落大小、質(zhì)地、顏色、色素有無等培養(yǎng)特征［13］;而菌絲和孢子絲通過插片法加以培養(yǎng)后在顯微鏡下進(jìn)行觀察［14，15］。生理生化特征的研究方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行研究并記錄結(jié)果［16］。

1.4.2 菌株NF38 的16S rDNA 基因序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株NF38 的DNA 的提取和擴(kuò)增參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行［17，18］。16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增采用保守引物27F (5＇-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇)和1492R(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)［19］。對 擴(kuò) 增 產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序工作委托上海生工生物工程有限公司完成。測定后的序列進(jìn)行基因登錄號的申請、模式菌株的選取、相似性比較和統(tǒng)統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建［20］。

1.5 菌株NF38 產(chǎn)酶條件的研究

1.5.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

接種有菌株NF38 的發(fā)酵培養(yǎng)基分別于10、20、25、30、35、40、50 ℃條件下進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm，培養(yǎng)7 d，測定CMCA 和FPA 酶活。

1.5.2 發(fā)酵初始pH 對產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中加入數(shù)滴1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH，使其初始的pH 值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，接種菌株NF38 種子液后置于30 ℃，150 rpm 搖床震蕩培養(yǎng)7 d，測定CMCA和FPA 酶活。

1.5.3 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

接種菌株NF38 的發(fā)酵培培養(yǎng)基于30 ℃，150 rpm 搖床震蕩培養(yǎng)，分別取3、4、5、6、7、8 d 和9 d 發(fā)酵液，測定CMCA 和FPA 酶活。

1.5.4 接種量對產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接種1%、5%、10%、15%、20%和30% 菌株NF38 種子液后置于30 ℃，150 rpm 搖床震蕩培養(yǎng)7 d，測定CMCA 和FPA 酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過兩次富集培養(yǎng)基的富集培養(yǎng)，淘汰了大部分不能利用CMC-Na 為唯一碳源的微生物，同時，在富集培養(yǎng)基中加入硫酸鏈霉素，又使得大部分細(xì)菌不能在其中生長篩選，使得篩選出具有纖維素降解放線菌的概率得到有效的提高。篩選得到放線菌NF38，顯示出良好的纖維素降解能力，其水解圈直徑D 和菌落直徑d 分別為23.6 mm、1.3 mm，D/d值為18.1，測定酶活為32.4 U/mL，放線菌NF38 水解圈如圖(圖1)所示。根據(jù)以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇NF38 為研究對象做進(jìn)一步研究。

2.2 菌株NF38 鑒定

2.2.1 放線菌的形態(tài)特征

菌株NF38 在高氏Ⅰ號平板上培養(yǎng)7 d 后，菌落直徑2～3 mm、白色隆起、邊緣整齊光滑(圖2)。氣生菌絲白色、基內(nèi)菌絲淡黃色;孢子絲為稍微的彎曲狀，螺旋不明顯，球形孢子鏈狀排列在一起，孢子表面光滑、黃色。

圖1 菌株NF38 剛果紅水解圈Fig.1 Hydrolyzed circle of NF38 by Congo-red

圖2 菌株NF38 菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of strain NF38

2.2.2 菌株NF38 培養(yǎng)特征

菌株NF38 除了在營養(yǎng)瓊脂上生長較差外，在其余培養(yǎng)平板上均生長良好，氣生菌絲以乳白色為主，而基內(nèi)菌絲的顏色多變，不同培養(yǎng)基表現(xiàn)出較大的差異性，在8 種不同培養(yǎng)基上具體培養(yǎng)特征見表1。

表1 菌株NF38 培養(yǎng)特征Table 1 The cultural characteristics of strain NF38

2.2.3 菌株NF38 生理生化特性

菌株NF38 特征中最為典型的是可以很好利用纖維素，革蘭氏染色呈陽性;在10～45 ℃溫度范圍內(nèi)生長正常，但最適生長溫度為30～40 ℃之間，培養(yǎng)期間沒有黑色素和H2S 的產(chǎn)生;菌株適宜生長pH為4.0～10.0 之間，最適生長pH 為7.4。

菌株NF38 對對碳源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可以有效利用實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中多數(shù)碳源，顯示出對碳源的利用譜較為廣泛，但是，對肌醇和L-阿拉伯糖不能利用。菌株NF38 生理生化和碳源利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)。

表2 菌株NF38 生理生化特征和碳源的利用情況Table 2 The physiological characteristics and carbon utilization of strain NF38

2.2.4 菌株NF38 16S rDNA 序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株NF38 的16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為1443 bp，通過在Bankit 上在線提交菌株序列擴(kuò)增方法、菌株來源等相關(guān)信息，獲得的基因登錄號為KF790691。菌株NF38 的16S rDNA 序列經(jīng)Blastn比對結(jié)果表明，該菌株與GenBank 中淺紫鏈霉菌(Streptomyces violascens)(EU273550)序列同源性最高。核酸序列比對軟件Clustal X(1.81)進(jìn)行alignment，利用MEGA 6.02 軟件包中的Kimura-2-Parameter Distance 模型計(jì)算進(jìn)化距離，以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，1000 次隨機(jī)抽樣計(jì)算自舉支持率(Bootstrap)，以評估系統(tǒng)發(fā)生樹的置信度［21］。由圖3 以看出菌株NF38 在進(jìn)化樹中與S.violascens(EU273550)親緣關(guān)系最近，且處于同一分支上，同源性達(dá)到99%。

綜合菌株NF38 形態(tài)學(xué)特征、碳源利用特征、生理生化特征和16S rDNA 序列的鑒定結(jié)果，將牛糞中獲得將具有纖維素降解能力的菌株NF38 鑒定為淺紫鏈霉菌(S.violascens)。

2.3 菌株NF38 產(chǎn)酶條件的研究

2.3.1 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

圖3 菌株NF38 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain NF38

在不同溫度發(fā)酵后收獲的粗酶樣品經(jīng)測活后實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4A，纖維素酶酶活和濾紙酶酶活在30～40 ℃區(qū)間內(nèi)酶的活性相對較高，其中，在35 ℃所產(chǎn)生CMCA 酶的活力最強(qiáng)32.4 U/mL，F(xiàn)PA 酶活為28.7 U/mL;但在40 ℃后急劇下降。這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能說明了該菌株長期生活在牛的腸道內(nèi)，適應(yīng)了腸道溫度環(huán)境，屬于體溫微生物。

2.3.2 發(fā)酵初始pH 對產(chǎn)酶的影響

圖4 溫度(A)、pH(B)、發(fā)酵時間(C)及接種量(D)對菌株NF38 產(chǎn)酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature (A)，pH value (B)，culture time (C)and inoculation amount (D)on cellulase production of strain NF38

在不同初始pH 值培養(yǎng)條件下收獲的粗酶樣品經(jīng)測活后實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4B，纖維素酶酶活和濾紙酶酶活在pH 為7.0～8.0 范圍內(nèi)維持在一個較高水平上，酶活分別達(dá)到頂峰，但是pH ＞8.0 以后會出現(xiàn)酶的活性迅速下降的現(xiàn)象，這說明了菌株NF38在中性或者是偏堿性的條件下，最有利于酶的產(chǎn)生和保持較高的活性。

2.3.3 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

在不同培養(yǎng)時間下收獲的粗酶樣品經(jīng)測活后實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4C，菌株NF38 培養(yǎng)3 d 后，纖維素酶酶活和濾紙酶酶活分別僅為6.95、3.46 U/mL，酶的活性在第7 d 時，活性最高，隨后逐漸降低?？赡苁且?yàn)榉啪€菌生長較為緩慢，代謝產(chǎn)物積累是在菌體生長的基礎(chǔ)之上，因此，需要較長的時間來才能達(dá)到最高;而之后會出現(xiàn)下降，是因?yàn)榫w生長進(jìn)入衰亡期，一方面菌體衰老死亡，細(xì)胞裂解的副產(chǎn)物導(dǎo)致酶的活力下降，另一方面所產(chǎn)生的酶隨著時間延長自身也會發(fā)生酶活下降現(xiàn)象。

2.3.4 接種量對產(chǎn)酶的影響

不同接種量經(jīng)發(fā)酵后，所收獲的粗酶樣品經(jīng)測活后實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4D，接種量在5%～10%范圍內(nèi)酶活基本保持在同一個較高水平。當(dāng)接種量＞10%時隨接種量增加酶活相反呈下降趨勢，可能是由于微生物的數(shù)量快速增加，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分被消耗并且已經(jīng)不能滿足酶的生物合成要求，導(dǎo)致酶還沒有來得及合成或不是其合成最佳條件，因此出現(xiàn)酶活下降的現(xiàn)象。

3 討論

隨著我國集約化養(yǎng)殖業(yè)的擴(kuò)大與人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，將畜禽糞便進(jìn)行堆肥化處理，是把這些廢棄物變廢為寶的有效途徑［22］。傳統(tǒng)的堆肥法是利用原料中的土著微生物來降解有機(jī)物質(zhì)，但由于其耗時較長，易產(chǎn)生臭味，且堆肥成品具有肥效較低與養(yǎng)料價值不高等缺點(diǎn)［23］。故人們在發(fā)酵過程中往往接種一些功能微生物，以便解決上述問題。將纖維素降解菌添加到畜禽糞便中進(jìn)行堆肥，使其有機(jī)物在功能微生物的作用下礦化與腐殖化，生產(chǎn)出生物有機(jī)肥［24，25］。這些生物有機(jī)肥施用農(nóng)田后能起到改良土壤和增加肥效的作用［8］，且能增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，對于自然生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，推動生態(tài)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的意義［26，27］。

本研究通過僅含有CMC-Na 為唯一碳源培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，根據(jù)透明圈的大小，從新鮮牛糞樣品中篩選到1 株具有較強(qiáng)纖維素降解能力的放線菌菌株NF38，酶活測定結(jié)果表明其值為32.4 U/mL，酶活較高，可作為畜禽糞便無害化處理中的潛力菌株。此外，本研究還對菌株NF38 的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明該菌株在溫度范圍為30～40 ℃區(qū)間內(nèi)酶的活力相對較高(最適溫度35 ℃);pH 范圍為7.0～8.0 時其酶活維持在較高水平上(最適pH 為7.0);接種量在5%～10%區(qū)間時其酶活基本保持較高水平(最佳接種量為5%);發(fā)酵時間在第7 d時達(dá)到產(chǎn)酶高峰。

本研究結(jié)合生理生化特征研究、形態(tài)學(xué)和和16S rDNA 序列分析結(jié)果，鑒定菌株NF38 為淺紫鏈霉菌(Streptomyces violascens)。而已有的研究表明從放線菌中篩選到能產(chǎn)生纖維素酶的活性菌株還很少見有文獻(xiàn)報道，目前僅有為數(shù)不多文獻(xiàn)報道了放線菌能夠產(chǎn)生纖維素酶的生物活性方面的研究，Waldron 等從土壤中分離得到一株產(chǎn)纖維素酶的放線菌Microbispora bispora，酶活為5.9 U/mL［28］;馮?，|等等從水稻秸稈垛下土壤分離出一株能降解纖維素JSD-1 放線菌，產(chǎn)酶活性為59.19 U/mL［29］。這與本研究中發(fā)現(xiàn)的淺紫鏈霉菌可產(chǎn)纖維素酶的報道有所不同，從而為纖維素降解菌的來源提供了一個新的優(yōu)良菌種。同時也有報道表明目前淺紫鏈霉菌主要用來提取L-谷氨酸氧化酶，而有關(guān)淺紫鏈霉菌產(chǎn)纖維素酶的報道還很鮮見，這也證明了微生物代謝產(chǎn)物的確具有多樣性。

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