珍珠菜中黃酮及Megastigmane 類化學成分研究

梁 東，劉彥飛，郝志友，陳若蕓，于德泉*

1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室，北京 100050;2廣西師范大學化學與藥學學院 藥用資源化學與藥物分子工程國家重點實驗室培育基地，桂林 541004

珍珠菜Lysimachia clethroides Duby 為報春花科珍珠菜屬植物，又名紅根草、紅頭繩(江西)、勞傷藥(云南)、酸罐罐(陜西)等［1］。全草入藥，廣泛分布于華北及長江以南各省區(qū)，具有清熱解毒、活血調(diào)經(jīng)、利水消腫等功效?，F(xiàn)代科學研究證明，珍珠菜屬主要化學成分為黃酮和三萜皂苷，主要具有細胞毒、抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［2］。為了有效利用這一資源，本課題組對珍珠菜進行了系統(tǒng)的化學成分研究，前期報道了從中分離得到的14 個三萜皂苷［3］、3 個二苯并-α-吡喃酮［4］、17 個有機酸［5］、4個黃酮苷和1 個δ-truxinate 衍生物［6］以及6 個其他類型化合物［7］。本實驗從珍珠菜乙醇提取物中分離得到12 個化合物，分別鑒定為山柰酚(1)、槲皮素(2)、cinchonain Ib(3)、芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(4)、芹菜素-6，8-二-Cα-L-吡喃阿拉伯糖苷(5)、芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃木糖苷(6)、芹菜素-6，8-二-Cβ-D-吡喃木糖苷(7)、芹菜素-6-C-β-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)、芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(10)、blumenol A(11)、(3S，5R，6R，7E，9S)-大柱香波龍-7-烯-3，5，6，9-四醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(12)。其中包括3 個黃酮苷元(1～3)、7 個黃酮碳苷(4～10)和2 個megastigmane 類化合物(11～12)，化合物3～8 和11～12 為首次從該屬植物中分離得到。體外活性測試結(jié)果顯示化合物1～12 均沒有明顯的細胞毒活性(IC50＞10 μM)。

1 儀器與材料

JASCO J-815 型圓二色散光譜儀;INOVA-600、Bruker-500 和Mercury-300 核磁共振儀測定NMR譜;Agilent 1100 系列LC/MSD Trap-SL 型液質(zhì)聯(lián)用儀測定ESI-MS;Lumtech 高效液相色譜儀，YMC C-18(250 × 20 mm，5 μm)色譜柱;Gilson 302 型中壓色譜儀;反相柱色譜硅膠RP-18(50 μm)為YMC 公司生產(chǎn);薄層色譜硅膠GF254及柱色譜硅膠(200～300 目)為青島海洋化工廠生產(chǎn);葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 為GE Pharmacia 公司生產(chǎn);所用試劑均為分析純或色譜純。

珍珠菜于2009 年9 月采于江西廬山，由九江縣森林植物研究所譚策銘研究員鑒定，標本(No.21787)保存于中國醫(yī)學科學院藥物研究所標本室。

2 實驗方法

2.1 提取與分離

珍珠菜地上部分10.0 kg，用70%乙醇加熱回流提取3 次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏。將浸膏懸浮于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(300 g)經(jīng)硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(1∶0～0∶1)、純甲醇梯度洗脫，得到Frs.A～N 共14 個部分。Fr.H 部分(6.5 g)經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以二氯甲烷作為流動相洗脫，得到Frs.H-1～6 共6 個流份。Fr.H-1 經(jīng)硅膠柱色譜和制備型HPLC，以甲醇-水(40∶60)等度洗脫，得到化合物11(15 mg，tR=45.8 min)。Fr.H-6 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)作為流動相洗脫得到化合物1(1.5 g)。Fr.K 部分(9.4 g)經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(1∶1)作為流動相洗脫，得到化合物2(0.8 g)。Fr.N 部分(10 g)經(jīng)中壓ODS 柱色譜，以甲醇-水(9∶1～0∶1)作為流動相梯度洗脫，得到Frs.1～30 共30 個流份。Fr.N-8 經(jīng)制備型HPLC，以乙腈-水(18∶82)等度洗脫(7 mL/min)，得到化合物3(29 mg，tR=35.5 min)。

正丁醇部分(500 g)經(jīng)硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇-水(10∶1∶0.1～1∶1∶0.1)、100%甲醇作為流動相梯度洗脫，得到Frs.A～H 共8 個部分。Fr.D 部分(66 g)經(jīng)硅膠柱色譜(二氯甲烷-甲醇-水，3∶1∶0.1～1∶1∶0.25，100% 甲醇)得到Frs.a～g 共7個部分。Fr.D-e 部分(15 g)經(jīng)中壓ODS 柱色譜，以甲醇-水(9∶1～0∶1)作為流動相梯度洗脫，得到Frs.1～30 共30 個流份。Fr.D-e-6 經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜和制備型HPLC，以甲醇-水(24∶76)等度洗脫，得到化合物12(19 mg，tR=58.4 min)。Fr.D-e-10 經(jīng)制備型HPLC，以乙腈-水(16∶84)等度洗脫，得到化合物8(5 mg，tR=43.3 min)。Fr.D-e-11經(jīng)制備型HPLC，以乙腈-水(19∶81)等度洗脫，得到化合物4(15 mg，tR=32.7 min)、5(40 mg，tR=37.3 min)、7(5 mg，tR=40.7 min)和6(30 mg，tR=51.5 min)。Fr.D-f 部分(30 g)經(jīng)凝膠Sephadex LH-20(甲醇)柱色譜，F(xiàn)rs.1～3 共3 個流份;Fr.D-f-2(17.4 g)經(jīng)反復中壓ODS 柱色譜和制備型HPLC，以甲醇-水(27∶73)等度洗脫，得到化合物9(34 mg，tR=90.5 min)和10(27 mg，tR=108.7 min)。

2.2 細胞毒活性(MTT 法)

收集生長良好的HT-29、HePG2、BGC-823、A549、A375 等五種腫瘤細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基配制成1 ×104cell/mL 細胞懸液，于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔100 μL(含1000 個腫瘤細胞)，置37oC，5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后加藥，實驗設空白對照，受試樣品設3 個濃度(0.1、1、10 μg/mL)，每濃度3 個平行孔，置37oC，5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)4 d。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 溶液(0.4 mg/mL，RPMI 1640 配制)100 μL，37oC 孵育4 h。棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，溶解Fomazan 顆粒，輕度振蕩后，用550 型酶標儀在檢測波長540 nm，參考波長405 nm 下測定OD 值。結(jié)果計算:以藥物的不同濃度及對細胞的抑制率作圖可得到劑量反應曲線，從中求出半數(shù)抑制濃度(IC50)。

3 實驗結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 黃色無定型粉末，ESI-MS m/z 285［M-H］-。1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)δ:8.03(2H，d，J=8.7 Hz，H-2＇，6＇)，6.91 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3＇，5＇)，6.43 (1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.18 (1H，d，J=1.8 Hz，H-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻［8］一致，故鑒定化合物1 為山柰酚(kaempferol)。

化合物2 黃色無定型粉末，ESI-MS m/z 301［M-H］-。1H NMR (DMSO-d6，300 MHz)δ:7.67(1H，d，J=2.1 Hz，H-2＇)，7.53 (1H，dd，J=8.4，2.1 Hz，H-6＇)，6.91 (2H，d，J=8.4 Hz，H-5＇)，6.39 (1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.18 (1H，d，J=1.8 Hz，H-6)。上述數(shù)據(jù)與文獻［8］一致，故鑒定化合物2 為槲皮素(quercetin)。

化合物3 無色結(jié)晶，ESI-MS m/z 453［M +H］+，475［M+Na］+。1H NMR (acetone-d6，500 MHz)δ:7.05 (1H，d，J=1.5 Hz，H-2＇)，6.82(1H，dd，J=8.0，1.5 Hz，H-6＇)，6.78 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5＇)，6.64 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5″)，6.58 (1H，d，J=2.0 Hz，H-2″)，6.49 (1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6″)，6.24 (1H，s，H-6)，4.90 (1H，s，H-2)，4.56 (1H，dd，J=6.5，1.5 Hz，H-7″)，4.29(1H，m，H-3)，3.10 (1H，dd，J=15.5，6.5 Hz，H-8″)，2.90 (2H，m，H-4)，2.86 (1H，dd，J=15.5，1.5 Hz，H-8″);13C NMR (acetone-d6，125 MHz)δ:168.3 (C-9″)，156.5 (C-5)，153.0 (C-9)，151.7(C-7)，145.7 (C-3″)，145.3 (C-3＇)，145.1 (C-4＇)，144.6 (C-4″)，135.2 (C-1″)，131.8 (C-1＇)，119.0(C-6″)，118.9 (C-6＇)，116.1 (C-5″)，115.6 (C-5＇)，114.8 (C-2＇)，114.6 (C-2″)，105.7 (C-8)，104.7 (C-10)，96.0 (C-6)，79.3 (C-2)，66.0 (C-3)，38.1 (C-8″)，34.8 (C-7″)，29.1 (C-4)。結(jié)合其1H NMR，13C NMR 及相關(guān)文獻［9，10］，確定化合物3為cinchonain Ib。NOESY 譜中，H-7″ (δH4.56)與H-2＇/ H-6＇的空間相關(guān)證實了該化合物的相對構(gòu)型，如圖1 所示［11］。在CD 譜(圖2)中，在231 nm和283 nm 處有強烈的負Cotton 效應，在256 nm 處有正Cotton 效應，參照文獻［10］，進一步確定了化合物3 的絕對構(gòu)型。

圖1 化合物3 的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of compound 3

圖2 化合物3 的CD 譜圖Fig.2 The CD spectrum of compound 3

化合物4 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 535［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.00 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，6＇)，6.92 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇，5＇)，6.74 (1H，s，H-3)，4.84 (1H，d，J=9.0 Hz，H-1″＇)，4.59 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)見表1。上述數(shù)據(jù)與文獻［12，13］一致，故鑒定化合物4 為芹菜素-6-C-β-D-吡喃木糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(apigenin-6-C-β-D-xylopyranosyl-8-C-α-L-arabinopyranoside)。

化合物5 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 535［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.13 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2＇，6＇)，6.91 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3＇，5＇)，6.76 (1H，s，H-3)，4.71 (1H，m，H-1″＇)，4.66 (1H，m，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)見表1。上述數(shù)據(jù)與文獻［12］一致，故鑒定化合物5為芹菜素-6，8-二-C-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(apigenin-6，8-di-C-α-L-arabinopyranoside)。

化合物6 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 535［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，500 MHz)δ:7.93 (2H，d，J=8.0 Hz，H-2＇，6＇)，6.93 (2H，d，J=8.0 Hz，H-3＇，5＇)，6.82 (1H，s，H-3)，4.70 (2H，d，J=9.0 Hz，H-1″，1″＇);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)見表1。上述數(shù)據(jù)與文獻［12］一致，故鑒定化合物6 為芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃木糖苷(apigenin-6-C-α-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-xylopyranoside)。

化合物7 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 533［MH］-。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:7.93 (2H，d，J=9.0 Hz，H-2＇，6＇)，6.93 (2H，d，J=9.0 Hz，H-3＇，5＇)，6.76 (1H，s，H-3)，4.79 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1″＇)，4.64 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)見表1。上述數(shù)據(jù)與文獻［12，14］一致，故鑒定化合物7 為芹菜素-6，8-二-C-β-D-吡喃木糖苷(apigenin-6，8-di-C-β-D-xylopyranoside)。

化合物8 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 563［MH］-。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.00 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，6＇)，6.90 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇，5＇)，6.73 (1H，s，H-3)，5.29 (1H，br s，H-1″)，4.73 (1H，d，J=10.2 Hz，H-1″＇);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)見表1。上述數(shù)據(jù)與文獻［15，16］一致，故鑒定化合物8 為芹菜素-6-C-β-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(apigenin-6-C-β-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside)。

化合物9 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 565［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.02 (2H，d，J=8.7 Hz，H-2＇，6＇)，6.89 (2H，d，J=8.7 Hz，H-3＇，5＇)，6.81 (1H，s，H-3)，4.71 (1H，d，J=9.9 Hz，H-1″)，4.75 (1H，d，J=10.2 Hz，H-1″＇);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)見表1。上述數(shù)據(jù)與文獻［12］一致，故鑒定化合物9 為芹菜素-6-C-α-L-吡喃阿拉伯糖基-8-C-β-D-吡喃葡萄糖苷(apigenin-6-Cα-L-arabinopyranosyl-8-C-β-D-glucopyranoside)。

化合物10 淡黃色粉末，ESI-MS m/z 565［M +H］+。1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:8.04 (2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，6＇)，6.92 (2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇，5＇)，6.73 (1H，s，H-3)，4.78 (1H，m，H-1″＇)，4.72 (1H，m，H-1″);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)見表1。上述數(shù)據(jù)與文獻［12］一致，故鑒定化合物10為芹菜素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖基-8-C-α-L-吡喃阿拉伯 糖 苷 (apigenin-6-C-β-D-glucopyranosyl-8-C-α-Larabinopyranoside)。

表1 化合物4-10a 的13C NMR 數(shù)據(jù)Table 1 13C NMR data of compounds 4-10a

a13C NMR data (δ)were measured in DMSO-d6at 125 MHz for 6 and at 150 MHz for 4-5，7-10.

化合物11 白色結(jié)晶(CDCl3)，ESI-MS m/z 449［2M+H］+。1H NMR (CDCl3，300 MHz)δ:5.90(1H，br s，H-4)，5.82 (1H，dd，J=15.9，5.4 Hz，H-8)，5.77 (1H，d，J=15.9 Hz，H-7)，4.41 (1H，m，H-9)，2.44 (1H，d，J=17.1 Hz，H-2a)，2.23 (1H，d，J=17.1 Hz，H-2b)，1.89 (3H，s，Me-13)，1.29(3H，d，J=6.3 Hz，Me-10)，1.07 (3H，s，Me-11)，1.00 (3H，s，Me-12);13C NMR (CDCl3，75 MHz)δ:41.2 (C-1)，49.6 (C-2)，198.4 (C-3)，126.8 (C-4)，163.3 (C-5)，79.0 (C-6)，135.6 (C-7)，129.0(C-8)，68.1 (C-9)，23.7 (C-10)，24.0 (C-11)，22.9 (C-12)，19.0 (C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻［17］一致，故鑒定化合物11 為blumenol A，為一megastigmane 類型的降倍半萜。

化合物12 白色無定形粉末，ESI-MS m/z 429［M+Na］+。1H NMR (CD3OD，500 MHz)δ:0.79(3H，s，H3-12)，1.09 (3H，s，H3-11)，1.14 (3H，s，H3-13)，1.21 (3H，d，J=6.5 Hz，H3-10)，1.52(1H，dd，J=12.4，1.9 Hz，H-2b)，1.69 (1H，t，J=12.0 Hz，H-2a)，1.71 (1H，dd，J=12.5，11.7 Hz，H-4b)，1.89 (1H，dd，J=12.9，1.9 Hz，H-4a)，3.09 (1H，t，J=8.1 Hz，H-2＇)，3.62 (1H，dd，J=11.9，5.0 Hz，H-6＇b)，3.80 (1H，dd，J=11.9，2.0 Hz，H-6＇a)，4.14 (1H，m，H-3)，4.28 (1H，quint d，J=6.0，1.0 Hz，H-9)，4.35 (1H，d，J=7.8 Hz，H-1＇)，5.73 (1H，dd，J=15.9，6.3 Hz，H-8)，5.99(1H，d，J=15.9 Hz，H-7);13C NMR (CD3OD，125 MHz)δ:40.7 (C-1)，44.5 (C-2)，73.2 (C-3)，42.4(C-4)，77.7 (C-5)，79.1 (C-6)，131.0 (C-7)，136.2 (C-8)，69.5 (C-9)，24.2 (C-10)，27.5 (C-11)，26.2 (C-12)，27.2 (C-13)，102.2 (C-1＇)，75.1(C-2＇)，78.1 (C-3＇)，71.6 (C-4＇)，77.8 (C-5＇)，62.7 (C-6＇)。上述數(shù)據(jù)與文獻［18，19］一致，故鑒定化合物12 為(3S，5R，6R，7E，9S)-大柱香波龍-7-烯-3，5，6，9-四醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷{(diào)(3S，5R，6R，7E，9S)-megastigman-7-ene-3，5，6，9-tetrol 3-O-β-Dglucopyranoside}。

3.2 化合物1～12 的細胞毒活性

采用MTT 法，測定了化合物1～12 的細胞毒活性。測試結(jié)果顯示化合物1～12 均沒有明顯的細胞毒活性(IC50＞10 μM)。

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