聚酰胺色譜結(jié)合高速逆流色譜分離制備萹蓄黃酮類化合物

孫兆林，王 曉，王岱杰，李 佳，段文娟*

1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟南 250355;2山東省分析測試中心山東省大型精密分析儀器應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，濟南 250014

萹蓄為蓼科植物萹蓄Polygonum aviculare L.的干燥地上部分［1-3］。《本草綱目》中載，用于“治霍亂，黃疸，利小便”?！兜崮媳静荨份d:“利小便。治五淋白濁、熱淋、瘀精澀閉關(guān)竅，并治婦人氣郁，胃中濕熱，或白帶之癥”等效用?，F(xiàn)民間廣泛用其治療泌尿系統(tǒng)的感染，結(jié)石及腎炎等疾病［4-6］?，F(xiàn)代臨床學(xué)報道:萹蓄對非胰島素依賴性糖尿病患者的治療是一種理想的藥物，療效顯著而持久，且無毒副作用［7］。因此建立相關(guān)成分的高效分離純化方法具有重要意義。

目前，萹蓄中化學(xué)成分的分離純化主要采用薄層色譜、硅膠柱色譜、聚酰胺柱色譜等傳統(tǒng)的分離純化方法［8］。這些方法存在耗時長、容易造成樣品的不可逆吸附變性及樣品回收率低等缺點。高速逆流色譜技術(shù)(high-speed counter-current chromatography，HSCCC)是不使用固態(tài)載體的液-液分配色譜［9，10］，根據(jù)樣品在兩相溶劑中分配系數(shù)的不同實現(xiàn)樣品的分離，避免了固相載體對樣品的不可逆吸附、變性等缺點，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化領(lǐng)域［11-16］。本研究首先采用聚酰胺色譜法對萹蓄中的黃酮類化合物進行富集，然后采用HSCCC 對富集了黃酮類成分的餾分進行分離純化，通過兩種色譜方法的結(jié)合，實現(xiàn)了對萹蓄中黃酮類化合物快速、有效的分離純化，得到了3 個高純度的黃酮類化合物，分別為楊梅樹皮苷，黃芪苷和合歡草素1(圖1)，為萹蓄資源的進一步開發(fā)應(yīng)用提供了一定的參考依據(jù)。

圖1 楊梅樹皮苷、黃芪苷、合歡草素1 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of myricitrin，astragalin and desmanthin-1

1 儀器與材料

高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)、TBP5002 泵(上海同田生物技術(shù)有限公司)、8823-B 紫外檢測器(北京賓達英創(chuàng)科技有限公司)、3057-11 記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)、KDM 型調(diào)溫電熱套(山東光明儀器有限公司)、超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)、SHB-B95 型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)、恒溫循環(huán)器(鄭州長城科技工貿(mào)有限公司)。Waters 600-996 高效液相色譜系統(tǒng)(配有光電二極管陣列檢測器(PDA)，美國Waters 公司)、Varian INOVA-600 核磁共振波譜儀(美國Varian 公司)、Agilent 1100 Series 6320 ion-trap 質(zhì)譜儀(美國Agilent 公司)，Agilent 6890N-5973N 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent 公司)。

甲醇、石油醚和乙酸乙酯均為分析純(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司);甲醇為色譜純(美國天地公司);實驗用水為過濾蒸餾水及娃哈哈純凈水;柱層析用聚酰胺粉(臺州市路橋四甲生化塑料廠)。萹蓄藥材購自山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為蓼科植物萹蓄的全草。

2 實驗方法

2.1 萹蓄粗提物的制備

將購買的2 kg 萹蓄藥材，經(jīng)粉碎機粉碎，過40目篩。將2 kg 藥材粉末平均置于兩個10 L 的圓底燒瓶中，加入6 倍量藥材的95%乙醇，加熱回流提取3 次，每次2 h，合并濾液，減壓蒸餾濃縮至無醇味。濃縮液用適量水混懸后，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取三次，得到乙酸乙酯層樣品38.4 g。

2.2 聚酰胺色譜初步分離

聚酰胺的前處理:將聚酰胺放在95%的優(yōu)質(zhì)工業(yè)乙醇中煮沸0.5 h，取出晾干，換上新的乙醇再煮，重復(fù)3～4 次，直至乙醇液無白色為止，取出晾干備用。

乙酸乙酯萃取物用甲醇溶解，均勻的拌樣于100 g 聚酰胺中，置70 ℃水浴鍋上蒸干上柱，依次用30%、60%、95%的乙醇洗脫，分別沖洗三個柱體積，減壓蒸干洗脫液分別得到餾分1(4.2 g)、餾分2(8.4 g)、餾分3(2.2 g)三個餾分，經(jīng)HPLC 檢測，餾分2(60%乙醇洗脫液)中具有黃酮類成分特征紫外吸收色譜峰(253 nm 和361 nm)的成分較多。

2.3 分配系數(shù)KD的測定

取少量樣品置于1.5 mL 試管中，加入等量的上下相各0.5 mL，劇烈震蕩0.5 min，使樣品充分溶解，靜置分層，取上下相各5 μL 分別用高效液相色譜(HPLC)進行檢測，上相峰面積為A1，下相峰面積為A2，分配系數(shù)KD=A1∕A2。

2.4 兩相溶劑體系及樣品溶液的制備

本實驗所用溶劑體系為乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(體積比4∶1∶5∶0.1)，按比例配制于分液漏斗中，劇烈振蕩使溶液充分混合，室溫下靜置過夜，分出上下相，使用前超聲脫氣30 min 備用。

稱取餾分2 樣品150 mg，加入上下相各10 mL，振蕩使其完全溶解，用于HSCCC 分離。

2.5 HSCCC 法分離制備過程

將兩相溶劑體系中已超聲脫氣的上相(固定相)，以20 mL/min 的流速泵入HSCCC 螺旋管中，待上相充滿整個螺旋管后，緩慢調(diào)節(jié)主機轉(zhuǎn)速至850 rpm，順時針旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，自HSCCC 首端以2.0 mL/min 流速泵入下相，同時開啟紫外檢測器，檢測波長為254 nm ;待上下相平衡后，將20 mL樣品溶液通過六通進樣閥注入HSCCC 色譜儀，根據(jù)色譜圖收集各色譜峰餾分。

2.6 HPLC 條件

萹蓄餾分2 樣品和HSCCC 分離后各色譜峰用HPLC 分析。色譜柱:Inertsil ODS-SP(250 mm ×4.6 mm，5 μm);柱溫:25oC;檢測波長:254 nm;流動相:甲醇(A)，0.2%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序:0～20 min，30%～70% A;20～30 min，70%～100%A;30～35 min，100% A。流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 HSCCC 分離條件優(yōu)化

溶劑體系的選擇是HSCCC 分離中的首要和關(guān)鍵環(huán)節(jié)，溶劑體系合適與否是由目標(biāo)化合物在兩相溶劑中的分配系數(shù)(KD)來衡量的。一般而言，對HSCCC 最合適的KD值范圍是0.5～2.0［17］。本實驗測定了目標(biāo)化合物在不同體積比的乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸溶劑體系中的KD值。實驗結(jié)果表明，當(dāng)采用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(體積比為4∶1∶5∶0.1)兩相溶劑體系時，可實現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離。目標(biāo)化合物在不同比例的乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸體系中的KD見表1。由表1 可看出乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸的體積比為3∶1∶6∶0.1、3∶2∶5∶0.1 時，3 種化合物的KD差異較大，能保證各組分間具有較好的分離度，但同時各物質(zhì)在固定相中的分配較多且黃酮類化合物在固定相中的KD偏大，若采用這2 種溶劑體系會使整體的分離時間過長，分離效率低，難以實現(xiàn)萹蓄中黃酮類成分的快速高效分離純化。如圖2 所示，應(yīng)用乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(體積比為4∶1∶5∶0.1)為兩相溶劑體系時，3 種黃酮類成分能夠在3h 之內(nèi)實現(xiàn)分離且分離效果良好。

表1 萹蓄60%乙醇粗提物中3 種化合物在不同比例溶劑體系中的KD值Table 1 Partition coefficients (KD)of the 3 flavones from P.aviculare crude extract under different two-phase solve systems

3.2 HSCCC 分離純化的結(jié)果

以乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(4∶1∶5∶0.1，v/v)為兩相溶劑體系，按照1.6 節(jié)所述的方法對萹蓄餾分2 進行分離純化。將150 mg 樣品溶于20 mL 等體積上相和下相混合溶液中進行HSCCC 分離(分離譜圖見圖2)，根據(jù)圖2 進行手動分段收集，得到化合物I、II，在尾吹液中得到化合物III。將各餾分減壓濃縮干燥，其質(zhì)量依次為7.5、13.8、20.6 mg。經(jīng)過HPLC 分析并應(yīng)用面積歸一法測定1、2、3，3 個化合物的純度分別為94.86%、94.28%和91.86%(分析結(jié)果見圖3)。

3.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

圖2 萹蓄中黃酮類化合物的高速逆流圖譜Fig.2 HSCCC chromatogram of flavone compounds from P.aviculare

化合物1 黃色粉末;FAB-MS(m/z):465(［M+H］+，100);EI-MS m/s(rel.int.%):318(100)，289(6)，149(6)，128(75)，113(28)，102(6)，85(14)，71(33)，58(82)。1H NMR(600 MHz，DMSOd6)，δ:6.88(2H，s，H-2＇，H-6＇)，6.37(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，5.19(1H，br，s，H-1＇＇)，0.84(3H，d，J=5.4 Hz，H-6＇＇)?；衔? 的FAB-MS 和1H NMR 數(shù)據(jù)與文獻［18］報道基本一致，故鑒定化合物1 為楊梅樹皮苷。

圖3 萹蓄中黃酮類化合物組分總樣(A)、楊梅樹皮苷(1)(B)、黃芪苷(2)(C)、desmanthin-1(3)(D)的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of P.aviculare crude extract (A)，myricitrin (1)(B)，astragalin (2)(C)and desmanthin-1 (3)(D)

化合物2 黃色粉末;FAB-MS(m/z):447(［MH］-，100);EI-MS m/s(rel.int.%):286(100)，258(16)，213(9)，184(3)，121(25)，105(4)，93(8)，65(15)。1H NMR (600 MHz，DMSO-d6)，δ:12.61(s，5-OH)，8.03(2H，d，J=8.4 Hz，H-2＇，H-6＇)，6.87(2H，d，J=8.4 Hz，H-3＇.H-5＇)，6.42(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.19(1H，d，J=2.4 Hz，H-6)，5.45(1H，d，J=7.2 Hz，H-1＇＇)?；衔? 的FAB-MS和1H NMR 數(shù)據(jù)與文獻［18］報道基本一致，故鑒定化合物2 為黃芪苷。

化合物3 黃色粉末;FAB-MS(m/z):615(［MH］-);EI-MS m/z(rel.int.%):318(65)，194(6)，170(29)，153(23)，126(100)，108(21)，97(9)，80(31)。1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)，6.93(2H，s，H-2＇，6＇)，6.38(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.4Hz，H-6)，5.48(1H，s，H-2＇＇)，5.47(1H，d，J=3.0 Hz，H-1＇＇)，0.84(3H，d，J=3.6 Hz，H-6＇＇)?；衔? 的FAB-MS 和1H NMR 數(shù)據(jù)與文獻［18］報道基本一致，故鑒定化合物3 為合歡草素1。

4 結(jié)論

萹蓄中的黃酮類化合物在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)方面非常相似，采用傳統(tǒng)的硅膠柱色譜、高效制備液相、聚酰胺柱色譜分離純化十分困難。本實驗首先應(yīng)用聚酰胺柱色譜法對萹蓄中的黃酮類化合物進行富集，然后采用HSCCC 對富集的黃酮類化合物進行分離純化，得到3 個高純度的黃酮類化合物楊梅樹皮苷、黃芪苷、合歡草素1。該方法簡便、快速、節(jié)省溶劑，具有較好的實用價值，為進一步開發(fā)利用萹蓄資源提供了一定的技術(shù)支撐。

1 Chinese Pharmacopoeia Commission (國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中國藥典).Beijing:China Medical Science Press (北京化學(xué)工業(yè)出版社)，2005，235.

2 Jiangsu New Medical College(江蘇新醫(yī)學(xué)院).Chinese Medicine Dictionary［中藥大辭典(下冊)］.Shanghai:Shanghai People＇s Publishing House (上海人民出版社)，1977，2330-2330.

3 Dai RC(代容春)，He WJ(何文錦)，Chen PQ(陳培泉)，et al.Determination of flavones in Polygonum aviculare L..Chin Wild Plant Res (中國野生植物資源)，2003，22(6):67-69.

4 Yan JM(嚴(yán)健民).The history status of the Bladder meridians of Foot-Taiyang in the theory of meridian.Chin J Basic Med Tradit Chin Med(中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志)，2003，9(11):57-59.

5 Meng ZW(孟昭威).The origin of formation and outlooks of the theory of meridian.Chin Acupunc(中國針灸)，1982，5:25-28.

6 Zhao RF(趙榮芳).Clinical observation of Polygonum aviculare L.on treatment of in 25 diabetic patients.Acta Acad Med Nantong(南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報)，1995，15:247-275.

7 Jiang CE(姜彩娥)，Hao R(郝睿)，Li CP(李春平).Distribution and drug resistance analysis of pathogenic bacteria causing urinary system infections.Chin Pharm Aff(中國藥事)，2006，20:311.

8 Yu S，Yu ZY，Duan WJ，et al.Isolation and purification of seven lignans from Magnolia sprengeri by high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr B，2011，879:3775-3779.

9 Wang DJ(王岱杰)，Liu JH(劉建華)，Geng YL(耿巖玲)，et al.The high-speed counter-current chromatography separation and purification of alkaloids Corydalis Decumbens(Thunb.)Pers.Chin J Anal Chem (分析化學(xué))，2010，38:783-788.

10 Sun YS(孫印石)，Liu ZB(劉政波)，Wang JH(王建華)，et al.Preparative isolation and purification of flavones from pericarpium citriReticulatae by high-Speed counter current chromatography.Chin J Chromatogr(色譜)，2009，27:244-247.

11 Wang X，Shi XG，Li FW，et al.Application of analytical and preparative high-speed counter-current chromatography for the separation of z-ligustilide from a crude extract of Angelica sinensis.Phytochem Anal，2008，19:193-197.

12 Zhao AH(趙愛華)，Zhao QS(趙勤實)，Lin ZW(林中文)，et al.The chemical composition of Polygonum aviculare L..Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2002，14(5):29-32.

13 Zhao HL(趙會禮).Determination of quercetin in Polygonum aviculare L.and P.plebeium R.Br.by HPLC.J Chin Med Pharmacol(中醫(yī)藥學(xué)報)，2004，32:17-20.

14 Xu XY(胥秀英)，Zheng YM(鄭一敏)，F(xiàn)u SQ(傅善權(quán))，et al.Quantitative determination of hyperoside and quercitrin and luteolin in Polygonum aviculare by HPLC.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2006，17:563-564.

15 Zheng XD(鄭旭東)，Hu HB (胡浩斌)，Zheng SZ(鄭尚珍)，et al.Studies on thevolatile constitiuents of Polygonum aviculare L.J Northwest Norm Univ，Nat Sci(西北師范大學(xué)學(xué)報，自科版)，1999，35(3):68-70.

16 Shu XK，Duan WJ，Liu F，et al.Preparative separation of polyphenols from the flowers of Paeonia lactiflora Pall.by high-speed counter-current chromatography.J Chromatogr B，2014，947-948:62-67.

17 Guan RJ(管仁軍)，Wang DJ(王岱杰)，Yu ZY(于宗淵)，et al.Preparative isolation and purification of the active components from Viticis Fructus by high-speed counter-current chromatography.Chin J Chromatogr (色 譜)，2010，28:1043-1047.

18 Chen XH(陳曉虎)，Chen DF(陳道峰).The study on chemical constituents of Polygonum aviculare L..China J Chin Materia Med(中國中藥雜志)，2004，29:918-919.