HPLC-ELSD 法測定不同炮制方法雪蓮果中低聚果糖的含量

郝 婷，尹志峰，王小青，高 楊，王良友

河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室 承德醫(yī)學院中藥研究所，河北 承德 067000

雪蓮果(Smallanthus sonchifolius)為菊科多年生草本，原產于南美洲安第斯山，是印弟安人傳統(tǒng)的塊莖食品［1，2］。雪蓮果含有20 多種人體必需的氨基酸和豐富礦物質。雪蓮果的主要成分為帶有甜味的低聚果糖，人體內沒有酶可以水解這種碳水化合物，因此難以吸收，糖尿病患者亦可使用。低聚果糖(fructooligosaccharides，簡稱FOS)又叫蔗果低聚糖或果聚糖，分子式為G-F-Fn(G 為葡萄糖基，F(xiàn) 為果糖基，n=1～3)，是果糖與葡萄糖構成的直鏈低聚糖，是蔗糖的果糖基以β-1，2 糖苷鍵與1～3 個果糖基結合而成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)的混合物。低聚果糖具有改善體內菌群，排毒清腸、改善脂質代謝，降低血脂、調節(jié)機體免疫系統(tǒng)，提高免疫力、促進礦物質吸收等生物活性［3-7］。本實驗采用HPLC-ELSD［8，9］測定方法對雪蓮果中低聚果糖的含量進行了測定，并比較不同炮制方法所得雪蓮果粉末中低聚果糖的含量，為雪蓮果的質量控制提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200 高效液相色譜儀(自動進樣器，四元泵，柱溫箱，ELSD 檢測器，Agilent 公司，美國);電子分析天平(瑞士梅特勒AG-245 型);CHRIST 實驗室型冷凍干燥機(德國MARTIN CHRIST);KQ-100E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品:蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖(批號:AWG0714，均購自上?；莩巧锟萍加邢薰?;乙腈(色譜純，天津星馬克科技發(fā)展有限公司)，水(娃哈哈飲品有限公司)其余試劑為分析純。本實驗所用雪蓮果經河北省承德醫(yī)學院趙春穎副教授鑒定為菊科植物雪蓮果(Smallanthus sonchifolius［Poepp.＆Endl.］H.Robinson)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:華譜XAmide(4.6 ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈∶水=75∶25;流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃。檢測器:ELSD，漂移管溫度70 ℃，氮氣體積流量3.5 L/min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱定對照品蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖20.3、21.0 和22.8 mg，用流動相溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配制成含有蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖2.03、2.10 和2.28 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.2 不同炮制方法制備的供試品溶液

將雪蓮果洗凈，切片，按照表1 方法對其進行處理。精密稱取粉碎后的粉末0.998 g，用0.3%檸檬酸溶液100 mL，超聲提取1 h，離心取上清液。

表1 不同雪蓮果炮制方法Table 1 Different processing methods of S.sonchifolius

2.3 標準曲線與線性范圍

取已配制的含有蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的混合對照品溶液，流動相依次2 倍稀釋成一系列濃度。在上述色譜條件下，分別進樣10 μL，每個濃度平行測定3 次，記錄峰面積，將濃度(Y)與峰面積(X)進行線性回歸，混合對照品及樣品色譜圖見圖1。

結果，蔗果三糖回歸方程Y=3630.7X-883.22，r=0.9991，線性范圍0.406～2.030 mg/mL;蔗果四糖回歸方程Y=3643.7X-774.31，r=0.9994，線性范圍0.420～2.100 mg/mL;蔗果五糖回歸方程Y=4700.7X-953.02，r=0.9978，線性范圍0.456～2.280 mg/mL。

圖1 混合對照品(A)及雪蓮果低聚果糖樣品(B)的HPLC-ELSD 色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed standards (A)and sample (B)

2.4 儀器精密度以及穩(wěn)定性

取2.2.1 項下的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖對照品溶液，各分別進樣10 μL，連續(xù)5 次，按2.1項下方法測定，記錄峰面積。取2.2.2 項下的樣品溶液，于制備后0、2、4、8、12 h 進樣10 μL，進行測定，按2.1 項下方法測定，記錄峰面積，計算出蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的RSD 分別為0.8%、1.1%、1.8%。結果RSD 均小于3%，表明此分析檢測系統(tǒng)精密度良好;樣品溶液在此條件下至少12 h穩(wěn)定。

2.5 樣品重現(xiàn)性以及回收率

稱取同一批雪蓮果粉末樣品，按照2.2.2 項下的方法制備樣品溶液5 份。進樣10 μL，按2.1 項下方法測定，記錄峰面積，并計算樣品中的準確含量，結果蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖質量分數(shù)分別為12.53%、20.14%、10.82%，其RSD 分別為1.2%、1.5%、2.6%，結果RSD 均小于3%，說明該方法重現(xiàn)性良好。

稱取已知含量的雪蓮果粉末10 mg，共6 份，分別精密加入蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖對照品適量，按照2.2.2 項下的方法制備樣品溶液，按2.1 項下方法測定，計算加樣回收率，結果平均回收率分別為101.4%、99.7%、98.6%，RSD 分別為1.53%、1.29%、2.81%。

2.6 樣品測定

取不同處理方法所得的雪蓮果，按照2.2.2 項下的方法制備樣品溶液，按2.1 項下方法測定，計算3 種低聚果糖的含量，見表2。

表2 不同處理方法雪蓮果低聚果糖的含量Table 2 Determination results of fructooligosaccharides prepared by different processing methods

由表2 可以看出不同處理方法的雪蓮果中都是蔗果四糖的含量最高，蔗果三糖次之，蔗果五糖最少。而且明顯第四種處理方法即清水漂洗0.5 h 后冷凍干燥的雪蓮果中蔗果四糖和蔗果五糖的含量明顯高于其他處理方法。

3 討論

用甲醇-水、乙腈-水進行梯度及不同比例的等度洗脫比較，結果表明采用乙腈-水(75∶25)為流動相不但基線穩(wěn)定，而且色譜峰在30 min 內達到良好分離且峰形漂亮。漂移管溫度和氣體流速是ELSD檢測中至關重要的2 個參數(shù)，根據(jù)反復比較實驗確定漂移管溫度為70 ℃，氮氣流速為3.5 L/min。

通過對雪蓮果中低聚果糖含量測定，可以看出不同處理方法的雪蓮果中都是蔗果四糖的含量最高，蔗果三糖次之，蔗果五糖最少。而且明顯第四種處理方法即清水漂洗0.5 h 后冷凍干燥的雪蓮果粉末中蔗果四糖和蔗果五糖的含量明顯高于其他處理方法。由表2 可以明顯看出四種處理方法中清水漂洗0.5 h 后冷凍干燥這種處理方法最好。雪蓮果塊根中低聚果糖含量是所有植物中含量最高的，其干物質中的45%～65%含量是低聚果糖，因此雪蓮果具有“低聚果糖之王”的美稱。低聚果糖作為人和動物的生理活性物質，廣泛應用在疾病診斷與防治、營養(yǎng)與保健、畜牧養(yǎng)殖、植物生長調節(jié)及抗病害等方面，它的開發(fā)在國際上已經發(fā)展成為一個應用于醫(yī)藥、食品、飼料、農業(yè)等領域的重要產業(yè)。

1 You Y(游懿)，Gong FC(龔福春).Studies on extraction and analysis of fructooligosaccharides in Smallanthus sonchifolius.Changsha:Changsha University of Science ＆ Technology (長沙理工大學)，MSc.2011.

2 Wu Y(武瑩).雪蓮果中糖類成分分析及低聚果糖制備工藝路線初探.Beijing:Beijing University of Chinese Medicine，MSc.2008.

3 Li XH(李新海)，Liang ZH(梁兆輝)，Cai JY(蔡錦源)，et al.Study on the extraction of oligosaccharides from Yacon by microwave-assisted extraction.Chin J Pharmacovigil (中國藥物警戒)，2011，8:145-147.

4 Chen XL(陳學玲)，Guan J(關健)，He JJ(何建軍)，et al.Function and application of Yacon.Acade Period Farm Prod Proc (農產品加工.學刊)，2010，10:18-19.

5 Han X(韓笑)，Yang M(楊明)，Cui CB(崔承彬)，et al.Quantitive determination of inulin type oligosaccharides in Morinda officinalis by HPLC.Milit Med Sci (軍事醫(yī)學)，2011，35:296-298.

6 Hond ED，Geypens B，Ghoos Y.Effect of high performance chicory inulin on constipation.Nutri Res，2000，20:731-736.

7 Lobo AR，Colli C，Alvares EP.Effects of frutans-containing yacon (Smallanthus sonchiflius Poepp and Endl.)flour on caecum mucosal morphometry，calcium and magenesium balance，and bone calcium retention in growing rats.Br J Nutr，2007，97:776-785.

8 Wei JX(魏軍香)，Zhang YJ(張躍進)，Liang ZS(梁宗鎖)，et al.HPLC analysis of chlorogenic acid content in yacon tubers under different storage conditions and storage time.Acta Agric Boreali-occident Sin (西北農業(yè)學報)，2012，21:118-122.

9 Zheng MM(鄭明敏)，Li JW(李靜威)，Liu J(劉堅)，et al.Determination of changes in sugar compositions of yacon under different storage conditions by HPLC.Food Sci(食品科學)，2009，30:190-193.