鼻息肉患者外周血Th9細(xì)胞檢測(cè)及意義*

王悅馬永明濮曉萍

鼻息肉患者外周血Th9細(xì)胞檢測(cè)及意義*

王悅1馬永明1濮曉萍1

目的檢測(cè)鼻息肉患者外周血中Th9細(xì)胞的比率，初步探討其與鼻息肉形成的關(guān)系。方法標(biāo)本取自40例鼻息肉患者、20例單純鼻出血或鼻中隔偏曲患者的外周靜脈血，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鼻息肉組和對(duì)照組外周血中Th9細(xì)胞的比率。結(jié)果鼻息肉患者外周靜脈血中Th9細(xì)胞的比率（1.29%±0.18%）明顯高于對(duì)照組（0.45%±0.14%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論Th9細(xì)胞在鼻息肉發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

鼻息肉；T細(xì)胞亞群；Th9細(xì)胞；外周血

鼻息肉（nasalpolyps，NP）是鼻腔鼻竇的常見病，也是耳鼻咽喉科的多發(fā)病。鼻息肉好發(fā)于成年人，男女發(fā)病比例約為2∶1。目前，鼻息肉的發(fā)病機(jī)制并不明確。臨床治療主要以鼻內(nèi)局部糖皮質(zhì)激素和功能性鼻內(nèi)鏡手術(shù)為主，但讓人煩惱的是鼻息肉的復(fù)發(fā)率較高，嚴(yán)重的鼻息肉病患者復(fù)發(fā)率甚至達(dá)到50%[1,2]，另外一些因素（包括哮喘、阿司匹林敏感、囊性纖維化等）也會(huì)增加鼻息肉的復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。為了從病因上治愈鼻息肉或者減少它的復(fù)發(fā)，研究者對(duì)鼻息肉的發(fā)生機(jī)制做了大量研究分析，并取得了很大進(jìn)步。目前普遍認(rèn)為，鼻息肉的形成是各種使鼻黏膜慢性炎癥病變的因素綜合作用的結(jié)果，其中炎性細(xì)胞因子在它的形成中起著重要作用。

輔助性T細(xì)胞9（T help 9 cells，Th9）是一種不同于Th1、Th2、Th17及Treg細(xì)胞的新型CD4+效應(yīng)性T細(xì)胞亞群，它以分泌白介素9（IL-9）和IL-10為主[3,4]，而人Th9細(xì)胞并不分泌IL-10[5]。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)Th9細(xì)胞在很多炎性疾病中都有較高水平表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鼻息肉患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD3+CD8-IL-9+T（Th9）細(xì)胞占CD3+CD8-T細(xì)胞的比率，初步探討Th9細(xì)胞在鼻息肉發(fā)病機(jī)制中的作用和臨床意義。

材料與方法

1 臨床資料

所有標(biāo)本來自2013年10月至2014年5月江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院耳鼻咽喉科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)的患者，所有患者均簽署知情同意書。慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者40例，其中男22例，女18例；年齡24~ 65歲，平均年齡43歲?；颊邽槌醢l(fā)或復(fù)發(fā)，病程均在1年以上，均有鼻塞、膿涕和頭痛癥狀，其中30例有嗅覺減退，藥物治療無明顯改善。CT掃描、鼻內(nèi)鏡檢查及手術(shù)中發(fā)現(xiàn)鼻息肉樣新生物，術(shù)后病理結(jié)果回報(bào)均為鼻息肉。單純鼻出血或鼻中隔偏曲患者20例為對(duì)照組，其中男13例，女7例；年齡18~47歲，平均年齡31歲。該組患者無任何其他鼻腔疾病史，近期無上呼吸道感染，鼻竇CT陰性，鼻內(nèi)鏡下見鼻腔黏膜正常，無息肉樣組織。所有患者術(shù)前1月停用全身和局部用藥，患者均無全身疾病及變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病。取外周靜脈血2ml，收于乙二胺四乙酸二鉀真空采血管，隨后3h內(nèi)提取單個(gè)核細(xì)胞。

2 試劑和儀器

人淋巴細(xì)胞分離液（ficoll）選自天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心。單抗隆抗體（包括PE-抗人IL-9，PE-Cyanine5-抗人CD3，F(xiàn)ITC-抗人CD8）、相應(yīng)同型抗體、細(xì)胞破膜液及洗滌液均購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司。刺激霉素PMA，離子霉素（Ionomycin）及莫能霉素（monensin）購(gòu)自Enzo公司。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清和RPMI-1640液選自維森特生物技術(shù)有限公司。0.01mol/L無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.2）自配。流式細(xì)胞儀FACSCanto及FACSDiva軟件為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

3 實(shí)驗(yàn)方法

提取單個(gè)核細(xì)胞：將外周血2000rpm/min，4℃，離心5min，去上層血清。用等體積PBS稀釋血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞緩緩加到等體積的ficoll液面之上，2000rpm/min，24℃，a=0，離心15min。取中間白膜層（單個(gè)核細(xì)胞層），用1mlPBS洗滌2遍，500g/min，4℃，離心5min，去上清。用1ml10%胎牛血清1640稀釋單個(gè)核細(xì)胞。取10ul，PBS稀釋5倍，顯微鏡下鮑氏計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù)。

流式細(xì)胞術(shù)：24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板每孔2×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，每孔分別加入5μl PMA（10ng/μl），1μl離子霉素（1μg/ul），4μl莫能霉素（0.5μg/μl），加10%胎牛血清1640使總體積為1ml，放入37℃、5% CO2孵箱刺激5h。后收細(xì)胞于無菌EP管，1ml PBS洗兩遍，500g/min，4℃，離心5min。留100μlPBS重懸，加PE-Cyanine5-抗人CD3 2μl，F(xiàn)ITC-抗人CD8 4μl，置混勻器，4℃冰箱，避光孵育30min。離心去上清，1mlPBS洗滌兩遍，500g/min，4℃，離心5min。每管加500μl破膜液破膜，置混勻器上，4℃冰箱，避光30min。離心去上清，1ml洗滌液（原液用雙蒸水按1: 9比例稀釋）洗兩遍，500g/min，4℃，離心5min。留40μl洗滌液，加PE-抗人IL-9 2μl，置混勻器，4℃冰箱，避光孵育1h。1ml洗滌液洗兩遍，500g/min，4℃，離心5min，去上清。250ulPBS重懸，50ul多聚甲醛固定。所有標(biāo)本均做同型對(duì)照，用FACS Canto檢測(cè)Th9細(xì)胞的比率，并用BD FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果以CD3+CD8-IL-9+T細(xì)胞在CD3+CD8-T細(xì)胞中的比率統(tǒng)計(jì)。既往研究證實(shí)PMA刺激會(huì)使T細(xì)胞胞膜CD4分子表達(dá)下降而影響檢測(cè)，因此本實(shí)驗(yàn)以CD3+CD8-IL-9+代表CD3+CD4+IL-9+。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（+s）表示。定量資料兩獨(dú)立樣本之間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

圖1所示，鼻息肉組中Th9細(xì)胞的比率較高（1.22%，圖a），而對(duì)照組Th9細(xì)胞比率相對(duì)較低（0.51%，圖b）。應(yīng)用t檢驗(yàn)得出結(jié)論，鼻息肉組（1.29±0.18%，圖c）較對(duì)照組（0.45±0.14%，圖c）外周血中Th9細(xì)胞的比率顯著增高，且兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.686，P＜0.01）。

圖1 鼻息肉組和對(duì)照組外周血Th9細(xì)胞檢測(cè)

討論

鼻息肉是一種由多種因素共同作用所導(dǎo)致的慢性持續(xù)性炎癥性疾病，以鼻腔鼻竇炎癥及極度水腫的鼻黏膜為主要特征，病理組織表現(xiàn)為大量的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。關(guān)于鼻息肉如何形成以及為何有較高的復(fù)發(fā)性是研究的難題。

一直以來，鼻息肉的發(fā)生機(jī)制是研究熱點(diǎn)，對(duì)此，各個(gè)學(xué)者所持觀點(diǎn)不同。傳統(tǒng)觀點(diǎn)一致認(rèn)為，鼻息肉的發(fā)生與感染和免疫因素密切相關(guān)。近年來，細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究顯示，一些特殊的細(xì)胞因子對(duì)鼻息肉形成可能起著更重要的作用。

Th9細(xì)胞是一群依賴IL-4和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）產(chǎn)生的新型CD4+Th細(xì)胞亞群[3,4]，它主要分泌IL-9和IL-10。其中IL-9具有多種生物學(xué)效應(yīng)[6]，可促進(jìn)各種炎性細(xì)胞如T細(xì)胞、B1亞型淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的擴(kuò)增，抑制Th1細(xì)胞類細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)Th2類細(xì)胞因子的表達(dá)，在免疫球蛋白合成的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。IL-9還可作用于組織細(xì)胞，在各種炎性疾病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[7]。而IL-10具有免疫抑制功能，對(duì)炎癥有一定的抑制作用。研究者將IL-9+IL-10+T細(xì)胞導(dǎo)入缺乏RAG-1的小鼠體內(nèi)后，最終誘發(fā)了腸炎[3]，提示Th9細(xì)胞分泌的IL-9的促炎作用大于IL-10的抗炎作用，Th9細(xì)胞可能以IL-9的促炎作用為主，至于IL-10是否發(fā)揮作用尚不清楚。

新的研究發(fā)現(xiàn)[5]，人Th9細(xì)胞與小鼠不同，它并不分泌IL-10，而以分泌的大量IL-9發(fā)揮主要作用。Th9細(xì)胞在多種炎性疾病中有重要作用[8]，這為本次實(shí)驗(yàn)提供了研究思路。Th9細(xì)胞是否在鼻息肉患者中也有較高表達(dá)？通過文獻(xiàn)查閱，發(fā)現(xiàn)目前關(guān)于Th9細(xì)胞與鼻息肉發(fā)病的研究報(bào)道甚少，此前我們課題組應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)局部鼻息肉組織中的IL-9進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中有較高水平的IL-9浸潤(rùn)[9]，由此我們推斷Th9細(xì)胞可能對(duì)鼻息肉的發(fā)生發(fā)展起著一定作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了鼻息肉患者外周血中Th9細(xì)胞的比率，發(fā)現(xiàn)該比率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。認(rèn)為Th9細(xì)胞分泌的IL-9通過血液循環(huán)高水平聚集于局部鼻黏膜組織，促使鼻腔鼻竇的炎性反應(yīng)，長(zhǎng)期刺激使鼻黏膜破壞與重塑，最終導(dǎo)致息肉形成。已有研究發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)性鼻炎[10]和哮喘[11]等變態(tài)反應(yīng)疾病中IL-9都有較高表達(dá)，為排除此干擾因素，故本實(shí)驗(yàn)中所有患者已排除變態(tài)反應(yīng)疾病。

本研究結(jié)果提示外周血中Th9細(xì)胞的高表達(dá)與鼻息肉的發(fā)生發(fā)展可能存在某種聯(lián)系，至于在鼻息肉形成過程中具體哪一環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用還有待于進(jìn)一步探討。

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（收稿:2015-03-12）

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.02.016

鎮(zhèn)江市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目資助（SH2013053）

1 江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（鎮(zhèn)江，212002）

馬永明，主任醫(yī)師. Email: maym121@163.com