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    熊貓糞便中纖維素降解菌的篩選與鑒定

    2015-01-07 07:05:14曹涵文吳瓏韜甘乾福鮑若虹梁學武
    家畜生態(tài)學報 2015年6期
    關鍵詞:裝液產(chǎn)酶羧甲基

    曹涵文,吳瓏韜,甘乾福,鮑若虹,梁學武

    (福建農林大學 動 物科學學院,福建 福 州350002)

    纖維素是自然界中廣泛存在的一類結構性碳水化合物,每年通過陸生及海洋藻類的光合作用,可產(chǎn)生0.85×1011t纖維素,相當于世界總能值消耗的四倍[1],是地球上蘊藏最為豐富的可再生資源之一。纖維素是植物細胞壁的主要成分,由D-葡萄糖以β-1,4糖苷鍵組成的鏈狀高分子化合物。在纖維素中不僅存在著分子內氫鍵還存在著分子間氫鍵,在秸稈中纖維被半纖維素和木質素包裹并且通過結晶結構與之相連,從而導致纖維素的水解與糖化受到顯著的抑制作用。影響纖維素水解的因素還包括原材料的多孔性、纖維的結晶度、木質素以及半纖維素含量[2]。植物纖維水解為可溶性糖依賴于復雜纖維素酶的協(xié)同作用[3]。當今,隨著全球能源與糧食資源的大量消耗,人們迫切的希望找到一種將纖維素加以利用的新方法。

    大熊貓雖為肉食動物,但其食物多以竹筍和竹葉為主,平均每只成年大熊貓每日進食竹子量可達12.5 kg。大熊貓除消化竹子中90%以上的蛋白質和脂肪等營養(yǎng)物質外,還能利用8%的纖維素和27%的半纖維素[4]。黃河等[5]報道,大熊貓以竹子葉為食時,對粗蛋白、粗脂肪和半纖維素的消化率分別為61.5%、50.3%和23.3%;而當以竹筍為食時,消化率分別達71.9%、61.5%和29.6%,大熊貓對竹筍中營養(yǎng)物質的利用率高于竹葉。大熊貓雖然有著草食性哺乳動物進食特點,卻擁有典型的肉食性哺乳動物的消化系統(tǒng)。2010年大熊貓的基因組序列公布[6],從其基因組序列中可以找到編碼與肉食性動物消化系統(tǒng)相關酶的基因,但編碼纖維素酶的相關基因卻并沒有被發(fā)現(xiàn),因此大熊貓對纖維素的消化必然要依賴腸道菌群的作用。孫飛龍等[7]研究了不同時期大熊貓腸道的菌群種類及分布,證明了熊貓腸道內纖維素的利用依靠菌群的協(xié)作。本試驗對大熊貓糞便中的纖維降解菌進行分離鑒定,和對產(chǎn)酶特性進行研究,探索熊貓腸道內能夠高效利用纖維素的菌株,為實現(xiàn)高纖維類資源飼料化提供支撐[8]。

    1 材料與方法

    1.1 樣品的采集

    大熊貓糞便采集于福州動物園,采集時去除表面雜質,裝入自封袋中并編號,取樣是在滅菌的超凈工作臺中進行,將糞樣用滅菌的刀片剖開,于中心位置取樣,剩余糞樣-20℃保存。

    1.2 纖維素降解菌的培養(yǎng)及篩選

    纖維素降解菌的培養(yǎng)利用了察克貝氏培養(yǎng)基[9],羧甲基纖維素(CMC)作為唯一碳源。其主要成分包括羧甲基纖維素10 g;MgSO4·7 H2O 0.2 g;K2HPO41 g;NH4NO31 g;FeCl3·6 H2O 0.05 g;CaCl20.02 g。將糞樣加入到液體培養(yǎng)基中恒溫震蕩培養(yǎng)3 d,將菌液稀釋到10-6、10-7、10-8并涂布到平板上,25℃倒置培養(yǎng)3 d。取純化后的菌液20μL滴加到培養(yǎng)基中,待菌落長出后,用剛果紅染色1 h,然后用1 mol/L的無菌生理鹽水浸泡1 h,根據(jù)菌落產(chǎn)生透明水解圈直徑大小,評定菌株的產(chǎn)酶能力。

    1.3 酶活性檢測

    以葡萄糖的濃度為縱坐標,對應的吸光度為橫坐標,繪制葡萄糖標準曲線用于后續(xù)酶活性的測定。將發(fā)酵液于8 000 r·min-1、4℃條件下離心20 min所得到的上清液即為粗酶液。測定羧甲基纖維素酶(CMCase)活性、濾紙酶(FPase)活性,分別利用羧甲基纖維素和中性濾紙作為底物進行培養(yǎng),采用3,5-二硝基水楊酸顯色法[10]測定。酶促反應在25℃,p H為7.0的條件下進行。酶活性單位(U)定義為:在p H為7.0溫度為25℃的條件下,每分鐘產(chǎn)生相當于1μmol葡萄糖的還原糖所需的酶量為1個酶活性單位。將初篩得到的27株菌株接種至20 m L的試管中制成菌懸液,然后接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng),25℃,150 r/min培養(yǎng)3 d后測定發(fā)酵液的酶活。

    1.4 菌落及細胞形態(tài)學觀察

    形態(tài)學觀察包括細胞形態(tài)鑒定和菌落形態(tài)鑒定兩類,菌落形態(tài)鑒定主要是了解菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特等。細胞的形態(tài)鑒定主要是通過革蘭氏染色[11],借助顯微鏡對細胞的 大小、結構、排列方式以及芽孢、鞭毛、細胞膜等進行觀察[12]。

    1.5 菌株的生理生化試驗

    細菌生理生化測定參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[13]的有關方法進行測定。主要包括糖醇的發(fā)酵實驗、淀粉的水解實驗、V~P試驗、甲基紅試驗、明膠(Gelatin)液化試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗(接觸酶試驗)、硝酸鹽還原反應、p H生長測定等[14]。

    1.6 16S r DNA序列分析

    采用試劑盒法提取菌液中菌株的DNA,利用微生 物 16S r DNA 通 用 引 物 27F(5'-AGAGTT TGATCATGGCTC AG-3')、1492R(5'-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3')[15]對 其 16S r DNA序列進行擴增,PCR產(chǎn)物回收純化后與p MD19-T相連接,連接產(chǎn)物轉化Ecoli JM 109感受態(tài)細胞。挑取轉化子并提取質粒后PCR驗證[16],經(jīng)驗證確定轉入外源細菌16S r DNA片段的單菌落,最后將轉化子質粒送至上海英駿生物技術有限公司測序,將測序結果與GeneBank中已有序列進行比對。用NCBI建立系統(tǒng)發(fā)育樹,確定所選菌株的種屬[17]。

    1.7 菌株的產(chǎn)酶條件研究

    取適量的菌液及液體培養(yǎng)基置于250 m L錐形瓶中進行液體發(fā)酵,在培養(yǎng)溫度、初始p H、接種量以及裝液量不變的條件下,設置不同的培養(yǎng)時間作為梯度,通過測得菌液的CMCase活性大小,得出最佳的培養(yǎng)時間。同樣的方法可以得出,在單因素中達到最大酶活性時所需的培養(yǎng)溫度、p H、接種量以及裝液量[18]。

    利用CCD中心組合,判斷產(chǎn)酶條件的單因素之間有無交互作用,如表1所示。實驗設計基于二階數(shù)學模型:

    Y為響應值,β0為常數(shù)項βI、βIJ、βII為回歸系數(shù)xI、xJ為編碼后的變量(培養(yǎng)時間、裝液量、接種量、p H、溫度)。

    Y(酶活性)=20.89+5.050×10-3*A+0.010*B-0.017* C+1.248×10-3* D+0.039* E+9.426×10-5* A *B-1.596×10-3* A * C-0.010* A * D-5.531×10-3* A * E-0.013*B* C-0.014* B* D-8.721×10-3* B* E-0.019* C* D+0.018* C* E-4.998×10-3* D*E-1.790×10-3* A2+0.045*B2+0.064* C2-0.48* D2-0.30* E2

    A為培養(yǎng)時間,B為裝液量,C為接種量,D為p H,E為溫度。

    表1 CCD實驗設計中變量的編碼和水平表Table 1 Encoding and level of variance in CCD experiment

    2 結果與分析

    2.1 纖維素降解菌的篩選結果

    從初篩的菌落中選取大而明顯37株菌落,純化后接種于平板上,通過剛果紅染色及1 mol/L的NaCl浸泡,發(fā)現(xiàn)有27株具有明顯的透明圈。

    2.2 CMCase和FPAase酶活性測定結果

    2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

    圖1 染色的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of dyeing

    2.2.2 酶活性的測定 羧甲基纖維素酶(CMCase)活性、濾紙酶(FPase)活性結果如表2所示。

    結果表明,初篩所得到的菌株,能夠在以羧甲基纖維素為碳源的平板上產(chǎn)生透明圈,但一部分菌株不能很好的利用纖維素這種天然物質。根據(jù)CMCase和FPAase活力,選出生長旺盛,產(chǎn)酶能力較強的3號菌株并對其進行傳代培養(yǎng)。菌株經(jīng)過多次的傳代培養(yǎng),其產(chǎn)酶能力依然穩(wěn)定,沒有呈現(xiàn)出退化跡象,如表3所示。

    圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Standard curve of glucose

    2.3 菌株的形態(tài)學觀察

    在羧甲基纖維素鈉平板25℃培養(yǎng)72 h,該菌株菌落圓形,直徑0.25μm~0.4μm,乳白色,邊緣齊整,呈液滴狀、表面光滑,中凸,無光澤。革蘭氏染色結果為陰性,直的桿菌。如圖3所示。

    表2 菌株的復篩Table 2 Re-screening of bacterial strains

    表3 菌株的傳代培養(yǎng)Table 3 Subculture of the strain

    2.4 菌株的生理生化試驗

    NC020209菌株革蘭氏染色鑒定為陰性,好氧,有機化能異養(yǎng)。生長溫度范圍5~40℃,最適生長溫度為25~30℃。在p H為4.0~8.0的范圍內均能生長,最適p H為6.0。在培養(yǎng)基上長勢良好,根據(jù)該菌株對不同碳源和氮源的利用情況,對菌株進行鑒定。由表4可知菌株利用葡萄糖不產(chǎn)氣,可以利用麥芽糖、尿素、甘露糖、蔗糖、蕈糖、果糖,不能同化阿拉伯糖、甘油、棉籽糖、山梨糖、木糖、D-核糖、鼠李糖、木糖、乳糖、枸櫞酸鹽。靛基質試驗、硫化氫、VP、葡萄糖酸鹽試驗均為陰性,能夠將明膠液化單不能將淀粉水解,甲基紅試驗、氧化酶、接觸酶試驗均為陽性,初步鑒定該菌株為假單胞菌。

    圖3 菌株的形態(tài)學觀察Fig.3 Morphological observation of the strain

    表4 菌株NC020209的生理生化特性Table 4 Physiological-biochemical characteristic of the NC020209

    2.5 16S r DNA測序與分析

    該菌株通過PCR擴增16S r DNA片段的長度約為1 500 bp,選取親緣關系最近的24個菌株序列進行比較。由圖4可知,該菌株與Pseudomonas poae RE*1-1-14的同源性為99%,利用臨近序列分析法構建了菌株遺傳進化樹。由此判斷該菌屬于革蘭氏陰性好氧假單胞菌。

    2.6.1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響 NC020209菌株在培養(yǎng)18 h進入對數(shù)生長期,培養(yǎng)至36 h達到最大值,這個階段中菌株產(chǎn)生了大量的纖維素酶和濾紙酶等胞外酶,由圖5可知,最佳培養(yǎng)時間為36 h。

    2.6.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響 溫度對NC020209菌株的產(chǎn)酶能力有較大的影響。從圖6可知該菌株的產(chǎn)酶溫度范圍很廣,從10℃至25℃期間,其酶活性不斷的增加,25℃達到最大值,該菌株的最佳培養(yǎng)溫度為25℃。

    2.6.3 p H值對產(chǎn)酶的影響 由圖7可知,初始p H為4.0~5.5,NC020209菌株的產(chǎn)酶效果較好,產(chǎn)酶能力逐步提高。p H為6時產(chǎn)酶效果最好,當p H繼續(xù)增大,該菌株的產(chǎn)酶能力逐步下降并趨于平緩。

    2.6.4 接種量對產(chǎn)酶的影響 從圖8分析可知,NC020209菌株接種量在0.5%~3.5%期間,產(chǎn)酶效果較好且趨于平穩(wěn)。接種量在4%達到最高,接種量大于4%則產(chǎn)酶效果急劇降低。

    2.6.5 裝液量對產(chǎn)酶的影響 裝液量影響氧氣的溶解速率,進而影響菌株的產(chǎn)酶和生長[19]。由圖9可知,裝液量在10%~30%范圍內,NC020209菌株酶活性逐步提升,裝液量為30%,酶活性達到最大值。

    2.6.6 CCD中心組合實驗設計優(yōu)化發(fā)酵條件 圖10顯示了接種量和裝液量位于實驗設計的中心水平時,對NC020209菌株酶活性影響的等高線圖和響應面圖。由圖10可知,接種量為3.8%~4.1%,裝液量為37%~42%時,二者添加量過多或過少均會影響該菌株酶活性的大小。由培養(yǎng)時間與裝液量交互影響得出的等高線圖可以看出,這兩個變量沒有交互影響,說明接種量與裝液量變化能單獨引起該菌株酶活性的變化(P>0.05)。同理,培養(yǎng)時間、裝液量、接種量、p H、溫度等因素之間也不存在交互作用。

    3 討 論

    圖4 菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains

    圖5 培養(yǎng)時間對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of culture time on CMCCase synthesis of NC020209

    圖6 培養(yǎng)溫度對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of temperature on the CMCcase synthesis of NC020209

    圖7 p H對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of p H on the CMCCase synthesis of NC020209

    圖8 接種量對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on the CMCCase synthesis of NC020209

    圖9 裝液量對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of broth content on the CMCCase synthesis of NC020209

    大熊貓為肉食動物,其對纖維素的消化依賴于腸道菌群的協(xié)同作用。朱立峰等從大熊貓糞便樣本中提取的16Sr RNA序列發(fā)現(xiàn),大熊貓腸道菌群主要由梭菌綱(Clostridia)和厚壁菌門(Firmicutes)的芽胞桿菌綱(Bacilli)細菌組成[20]。通過測定熊貓腸道宏觀基因組,發(fā)現(xiàn)了纖維素酶和半纖維素酶的編碼基因[21],該實驗在分子水平上證明了熊貓利用腸道內微生物對竹子纖維素和半纖維素加以降解。王海娟[22]報道已發(fā)現(xiàn)的大熊貓腸道菌類共22種,分屬于7個菌門,分別是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、子囊菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、藍菌門。

    圖10 接種量和裝液量交互影響NC020209菌株酶活性水平的等高線圖及響應面圖Fig.10 Contour plots and response surface diagram of the effect of inoculum sizeand loaded liquid on NC020209 enzymatic activity

    本實驗從熊貓糞便分離到一株革蘭氏陰性好氧假單胞菌(NC020209菌株)。Zhang[23]等報道,假單胞菌所產(chǎn)生的漆酶,在降解植物細胞壁過程中起重要作用,它能瓦解纖維素的晶體結構,解除木質素對半纖維素和纖維素的封閉,從而增加其可及度,提高酶的水解效率。由此可見,正是假單胞菌對纖維類物質的“破壁”作用,才使得熊貓腸道內后續(xù)的纖維降解過程得以順利進行。采用DNS法測定酶活性及對產(chǎn)酶條件進行研究,培養(yǎng)溫度25℃,初始p H為6.0,接種量4%,裝液量為30%,搖床轉速為150 rpm的條件下培養(yǎng)36 h,所測得NC020209菌株酶活為24.362 U。

    [1] Rajoka I M,Malik A K.Cellulase production by Cellulomonas biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates[J].Bioresour Technol,1997,59:21-7.

    [2] Mc Millan J D.Pretreatment of lignocellulosic biomass.In:Himmel M E,BakerJ O,Overend R P,editors.Enzymatic conversion of biomass for fuels production[J].Washington,DC:American Chemical Society,1994.292-324.

    [3] Romanowska I,Polak J,Bielecki S.Isolation and properties of Aspergillus niger IBT 90 xylanase for bakery[J].Appl Microbiol Biotechnol,2006,69:665-671.

    [4] 樊 程,李雙江,李成磊,等.大熊貓腸道纖維素分解菌的分離鑒定及產(chǎn)酶性質[J].微生物學報.2012,52(9):1 113-1 121.

    [5] 黃 河,張志和,侯 蓉.糞樣在大熊貓研究上的應用[J].動物學雜志.2012,47(6):156-163.

    [6] Li R Q,F(xiàn)an W,Tian G,et al.The sequence and de novo assembly of the giant panda genome[J],Nature,2010,463(7279):311-317.

    [7] 孫飛龍,劉敬賢,席 丹,等.大熊貓腸道疾病致病菌[J].經(jīng)濟動物學報.2002,6(2):20-23.

    [8] Ragauskas A J,Williams C K,Davison B H,et al.The path forward for biofuels and biomaterials[J].Science,2006,311:484-489.

    [9] 付麗麗.作物秸稈纖維素降解菌的分離與篩選[D].浙江大學,2012:14-15.

    [10] 胡國全,鄧 宇,徐 恒,等.極端嗜熱厭氧纖維素菌的分離、鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及其酶學性質的研究[J].應用與環(huán)境生物學報,2004,10(2):197-201.

    [11] 孫紀全,黃 星,何 健,等.異丙隆降解菌Y57的分離鑒定及其降解特性[J].中國環(huán)境科學.2006,26(3):315-319.

    [12] 周生飛.高效降解棉酚菌種篩選、降解機理及固體發(fā)酵工藝研究[D].甘肅農業(yè)大學,2011:26-28.

    [13] 布坎南R E.伯杰氏細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,1988.

    [14] 解林奇.多菌靈降解菌系篩選、組成分析及其降解效果[D].北京:中國農業(yè)科學院,2012:33-37.

    [15] Baker G C,Smith J J,Cowan D A.Reviewandre-analysis of domain-specific 16S primers[J].Journal of Microbiological Methods,2003,55(3):541-555.

    [16] 呂莉華.瘤胃纖維素降解菌Real-Time PCR熒光定量方法的建立及其初步應用[D].呼和浩特:內蒙古農業(yè)大學,2007:16-18.

    [17] 孫一博.高效纖維素降解菌的篩選鑒定及特性研究[D].哈爾繽:東北農業(yè)大學,2013:24-29.

    [18] 張曉輝,郭春華,江曉霞.飼用木聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選及部分酶學性質的研究[J].獸藥與飼料添加劑,2007,12(2):4-6.

    [19] 郭 勇.酶工程[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1994:42-43.

    [20] Teather R M,Wood P J.Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen[J].Applied and Environmental Microbiology,1982,43(4):777.

    [21] 吳 華,詹祥江,張保衛(wèi),等.大熊貓微衛(wèi)星位點的篩選與鑒定[A].野生動物生態(tài)與資源保護第三屆全國學術研討會論文摘要集[C].2006.

    [22] 王海娟,潘 渠.大熊貓腸道正常菌群降解纖維素的機制[J].中國微生態(tài)學雜志.2014,26(2):225-228.

    [23] Zhang X,Xu C,Wang H.Pretreatment of bambooresidues with Coriolus versicolor for enzymatic hydrolysis[J].J Biosci Bioeng,2007,104(2):149-151.

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