預防使用氟康唑?qū)︻^孢哌酮引起的大鼠腸道真菌增殖和易位的影響

張帥民 羅湘蓉 石承先

（貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽550002）

真菌是生物界中的一大類真核細胞微生物，部分真菌與人體共棲，維持微生態(tài)平衡。真菌感染的發(fā)病主要取決于宿主免疫狀態(tài)、宿主體內(nèi)環(huán)境以及真菌毒力、數(shù)量等因素的相互作用。目前深部真菌感染在醫(yī)院感染中占重要地位，特別是近20多年來，尤其是抗生素廣泛使用，其持續(xù)上升趨勢明顯［1］，目前已成為住院患者感染及死亡的主要原因之一［2］。重癥 急 性 胰 腺 炎 （severe acute pancreatitis，SAP）病程合并深部真菌感染的發(fā)生率高達12%～24%［3］，而深部真菌感染也成為導致SAP高死亡率的重要原因之一［4］。在治療深部真菌感染策略［5］上目前主要有：經(jīng)驗治療、目標治療以及預防性治療。經(jīng)驗治療和目標治療多在診斷明確時采用抗真菌治療，此時真菌感染已經(jīng)較為嚴重，控制較困難，死亡率仍然較高。臨床上預防性應用氟康唑治療真菌感染也取得了顯著成效，可明顯降低真菌感染率及死亡率［6］。在預防性用藥時機方面，建議使用抗生素6～9d后預防使用抗真菌藥物是合適的，并可明顯降低真菌感染、住院時間、治療費用和死亡率［7］。但是國內(nèi)外學者對氟康唑在預防用藥的時間長短存在爭議［8］。本實驗通過使用抗生素后預防性使用氟康唑不同的時間，觀察對大鼠腸道真菌增殖及易位影響，以期為臨床上預防性使用真菌用藥時間提供實驗依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 動物分組 Wistar大鼠30只，體質(zhì)量200～250g，雌雄不拘，隨機分成三組，每組10只。三組大鼠每天均按體質(zhì)量比例使用頭孢哌酮舒巴坦鈉直至取實驗動物標本，每組動物均在使用抗生素后第7天始分別加用生理鹽水或氟康唑行腹腔注射，生理鹽水使用3d為A組，氟康唑使用3d為B組，氟康唑使用5d為C組。

1.2 復制大鼠腸道真菌增殖及易位的模型 大鼠均為清潔級，在實驗前1周開始分籠飼養(yǎng)于貴陽中醫(yī)學院基礎實驗室動物房，清潔級恒溫（20～25℃）環(huán)境，標準鼠糧喂養(yǎng)，自由取水，實驗前飼養(yǎng)1周。開始實驗時每只鼠每天按體質(zhì)量3.33g／kg［7］使用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉（cefoperazone sodium and sulbactam sodium，CSSS）至取標本前1d，用量分等量12h／次，每次用生理鹽水（normal saline，NS）稀釋抗生素至1mL，每次注射時大鼠腹部皮膚消毒，于大鼠右下腹部進針，有落空感回抽無尿液、腸液后固定針頭，緩慢注入藥液。A組于第7天每只鼠加用60mg／kg生理鹽水注射腹腔，連用3d后取標本，B、C組于第7天每只鼠加用60mg／kg氟康唑作腹腔注射，分別連用3d、5d后取標本，各組用量也分等量每1次／24h。各組動物給藥后的飼養(yǎng)均與實驗前相同。取標本前予大鼠戊巴比妥鈉按200mg／kg體質(zhì)量皮下注射，麻醉生效后先予大鼠股靜脈采集血液1.5mL后用止血鉗止血，然后常規(guī)消毒鋪巾開腹，自下腔靜脈抽血2.0mL，然后取腸系膜、胰腺、肺組織及腸內(nèi)容物作標本，最后用斷頭法處死大鼠。標本采集過程中均無菌操作。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 觀察動物的活動、精神狀況、體質(zhì)量、大便性狀及顏色等。

1.3.2 腸內(nèi)容物直接涂片鏡檢真菌 于大鼠肛門3cm處采集腸內(nèi)容物1.0g左右，取腸內(nèi)容物0.1g稀釋至100mL的生理鹽水（NS）中，用加樣槍吸取10uL滴在滅過菌的載玻片中央，將液滴涂布成一均勻的薄層；將標本玻片放于干燥箱干燥后，經(jīng)酒精燈火焰處來回通過2～3次固定標本，待標本冷卻后行革蘭氏染色（初染→水洗→媒染→水洗→脫色→復染→水洗），待標本干燥后置于顯微鏡下查找真菌，查看相同視野范圍內(nèi)各組真菌數(shù)量有無差異。

1.3.3 腸內(nèi)容物真菌培養(yǎng) 分別取每只大鼠腸內(nèi)容物0.1g稀釋至100mL NS中，取10μL接種于科瑪嘉顯色培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃度孵箱培養(yǎng)2～3d后觀察結(jié)果。10μL接種時每克腸內(nèi)容物真菌菌落數(shù)以培養(yǎng)基上真菌菌落數(shù)×106表示。

1.3.4 腸系膜、胰腺及肺組織培養(yǎng) 按無菌操作將腸系膜、胰腺、及肺組織適量取材后，分別放入營養(yǎng)肉湯試管培養(yǎng)基中，置于37℃孵箱中培養(yǎng)2～3d，如有微生物生長，將微生物轉(zhuǎn)移到科瑪嘉顯色培養(yǎng)基中予37℃孵箱培養(yǎng)2～3d后觀察有無真菌生長。

1.3.5 血液真菌培養(yǎng) 無菌操作，用一次性真空采血管自大鼠股靜脈采集血液1.5mL，將血液移至雙相血培養(yǎng)瓶行血培養(yǎng)，再將血培養(yǎng)瓶置于37℃孵箱培養(yǎng)2～3d后觀察結(jié)果。

1.3.6 血漿1－3－β－D葡聚糖檢測 無菌操作，自下腔靜脈采集血液2mL于無熱原肝素抗凝管，混勻，放入無熱原離心管中，用滅菌鋁箔封閉管口，然后使用低速離心機立刻進行3 000r／min離心，60s離心得富含血小板血漿，置于零下30℃冰箱保存，待批量檢測。取上述血小板血漿0.1mL加入裝有0.9mL樣品處理液中輕輕混勻后，70℃保溫10min，取出后立刻放入冷水浴中冷卻30℃以下，即為待測血漿樣品。取待測血漿樣品0.2mL加入酶反應主試劑中，待完全溶解后用加樣槍轉(zhuǎn)移至10mm×75mm標準玻璃反應管中（勿產(chǎn)生氣泡），立刻插入MD－80微生物動態(tài)檢測系統(tǒng)中進行反應，反應結(jié)束后自動計算血漿中1－3－β－D葡聚糖濃度，單位為pg／mL。廠家提供的對照血漿中真菌1－3－β－D葡聚糖（1－3－β－D glucan，1－3－G）正常值為＞20pg／mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。腸內(nèi)容物真菌數(shù)量及血漿1－3－β－D葡聚糖水平經(jīng)正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗后，用均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，腸系膜、胰腺、肺組織及血真菌培養(yǎng)結(jié)果采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。腸內(nèi)真菌數(shù)量、器官真菌易位數(shù)及血漿1－3－G水平之間的關系用線性相關分析。

2 結(jié) 果

2.1 動物的一般情況 整個實驗過程中30只大鼠均存活。在動物的食量、活動以及體質(zhì)量方面，A組明顯差于C組和B組；實驗期間稀便的總量A組多，B組次之，C組最少；在皮毛光滑方面C組最好，B組次之，A組最差。

2.2 腸內(nèi)容物真菌培養(yǎng)及菌落鑒定情況 從菌落生長速度、大小、形態(tài)、質(zhì)地、顏色、色素、菌落的邊緣、菌落的高度等方面來看，各組間無明顯差異，各組菌落經(jīng)法國梅里埃AP120CAUX真菌測試條檢測為鄒褶念珠菌。

2.3 三組動物腸內(nèi)容物真菌數(shù)量變化 從表1可見，三組動物使用抗生素后腸內(nèi)容物真菌數(shù)均高于正常wistar大鼠腸道真菌數(shù)量［8］，與A組比較，B組和C組隨著氟康唑用藥天數(shù)的增加，大鼠腸道真菌數(shù)量顯著減少（P＜0.05），B組就減少到了A組的大約1／10，C組腸道真菌增殖又較B組減少明顯（P＜0.05），C組甚至接近正常值。

2.4 三組動物腸系膜、胰腺、肺組織及血液真菌培養(yǎng)情況 從表2可見，A組動物使用抗生素后，組織和血培養(yǎng)40份標本中，有26份標本培養(yǎng)為陽性；與A組比較，B組和C組真菌易位至腸外組織器官總數(shù)量隨著氟康唑的應用時間增加而顯著減少，其中C組又較B組減少明顯（P＜0.05）。

2.5 各組動物血漿1－3－G水平的變化 如表1，各組血漿1－3－G水平均大于正常值（＜20pg／mL），血漿1－3－G水平隨著氟康唑用藥天數(shù)的增加而降低，B組和C組均較A組明顯減少（P＜0.05），C組比B組顯著降低并接近正常動物參考值，與腸內(nèi)容物真菌數(shù)量變化相一致。

2.6 腸真菌增殖、真菌腸外易位及血漿1－3－G水平之間的關系 如圖1～3，隨著腸道真菌增殖的增加，真菌易位至腸外組織器官總數(shù)和血漿1－3－β－D葡聚糖水平亦增加，腸道真菌增殖分別與真菌易位至腸外組織器官總數(shù)和血漿1－3－β－D葡聚糖水平呈正相關（r＝0.9230和0.943），真菌易位至腸外組織器官總數(shù)與血漿1－3－β－D葡聚糖水平亦呈正相關（r＝0.998）。

表1 三組大鼠使用不同時間氟康唑后腸道真菌的變化（±s）

表1 三組大鼠使用不同時間氟康唑后腸道真菌的變化（±s）

注：與A組比較，＊P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05。

359±64.20 82.25±6.84 B組 41.2±2.82＊ 49.48±5.70＊C組 4.5±1.49＊△ 25.64±6.79＊△正常參考值 3.89±2.52 ＜葡聚糖A組分組 腸內(nèi)容真菌菌落數(shù) 血漿1－3－β－D 20.00

表2 三組大鼠使用不同時間氟康唑后器官真菌易位數(shù)

圖1 腸真菌增殖與血漿1－3－G水平的關系

圖3 腸道真菌易位至腸外各組織器官總數(shù)與血漿1－3－G水平的關系

3 討 論

3.1 抗生素與腸道真菌增殖及易位的關系 廣譜抗生素種類較多，若多種藥物聯(lián)用，療程過長等，可使腸道某些敏感細菌過度被抑制，非敏感細菌增殖，正常菌群的生態(tài)平衡遭到破壞，形成菌群替代現(xiàn)象，甚至導致真菌惡性繁殖并易位，發(fā)生真菌感染。因此抗生素引起腸道真菌感染及易位在臨床上較常見［9］。玉芳等［10］研究也證實：細菌主要對抗生素敏感，而抗生素直接抑制其增殖，這樣可能間接促進了真菌生長。目前引起腸道真菌感染最主要的致病菌是念珠菌［11］。有研究調(diào)查從血液科病人分離到的真菌中，來源于腸道排名第一，占64.4%［9］，提示患者發(fā)生真菌感染時，腸道真菌是其重要來源。本實驗發(fā)現(xiàn)大鼠使用抗生素后引起腸道真菌明顯增殖及易位，與李克躍等［7］的研究結(jié)果相一致。這些提示使用較長時間的抗生素后，腸道真菌明顯增殖，進而發(fā)生腸外組織器官易位，這可能是長時間使用抗生素后誘發(fā)深部真菌感染的重要原因之一。

3.2 腸道真菌增殖及易位與血漿1－3－G的關系1－3－β－D葡聚糖是一種多糖，除接合菌外普遍存在于真菌細胞壁中，占真菌細胞壁干重的50%以上［12］，而其他微生物如人體細胞、細菌、病毒均缺乏此成分。當真菌感染時，真菌可進入人體血液或移位到其他組織，其被吞噬細胞吞噬、消化等處理，1－3－β－D葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其他體液（如尿、腹水、胸水等）中1－3－β－D 葡聚糖含量增高。因此對1－3－β－D葡聚糖的動態(tài)檢測，有助于快速診斷深部真菌感染，選擇正確抗真菌藥物對癥治療［13］。本實驗顯示，血漿1－3－β－D 葡聚糖水平隨著腸道真菌增殖及真菌易位至腸外各組織器官總數(shù)的減少而降低，腸道真菌增殖和易位與血漿1－3－β－D葡聚糖水平呈正相關；各組血漿1－3－β－D葡聚糖均高于實驗正常值（＜20pg／mL），在A組當血漿1－3－β－D葡聚糖最高時腸道真菌易位至腸外組織器官的總數(shù)高達26個，而C組1－3－β－D葡聚糖接近正常值時，腸道真菌易位至腸外組織器官總數(shù)僅有9個。提示檢測血漿1－3－β－D葡聚糖含量有助于早期發(fā)現(xiàn)真菌感染。

3.3 預防使用氟康唑?qū)δc道真菌增殖及易位的影響 預防性應用氟康唑可防止SAP發(fā)生真菌感染［6］，但使用多長時間比較合適無定論，如果使用時間長易引發(fā)耐藥并且也浪費，如果時間過短又達不到預防作用。本實驗表明預防性應用氟康唑3d后動物腸道真菌增殖明顯減少，5d時腸道真菌幾乎接近正常，腸道真菌易位至腸外組織的數(shù)量明顯減少，提示預防性使用氟康唑時間5d比較合適，這可能為我們在臨床工作中預防應用抗真菌藥物提供了實驗依據(jù)。

［1］ 陶家駒.侵襲性肺真菌感染診治的現(xiàn)狀及前景［J］.中國全科醫(yī)學，2007，7（10）：534－526.

［2］ 廖萬清，顧菊林.深部真菌感染治療的現(xiàn)狀與對策［J］.中國感染與化療雜志，2007，7（2）：401－403.

［3］ Gloor B，Muller CA，Worui M，et al.Pancreat ic infection in pancreat it is：the role of fungus and mult iresist ant organisms［J］.Arch Surg，2001，136（5）：592－596.

［4］ 騰秀池，李銳.重癥急性胰腺炎合并深部真菌感染診治分析［J］.中國急救醫(yī)學，2008，28（4）：300－302.

［5］ 李光輝.深部真菌感染診斷治療進展［J］.中國感染與化療雜志，2008，8（4）：277.

［6］ 湯可立，石承先.氟康唑預防重癥急性胰腺炎真菌感染32例［J］.世界華人消化雜志，2010，18（15）：1608－1611.

［7］ 李克躍，石承先.使用不同時間頭孢哌酮對大鼠腸道真菌增殖和易位的影響［J］.貴陽中醫(yī)學院學報，2011，33（3）：122－125.

［8］ 鄭旭銳，楊宇.從肺腸微生態(tài)變化研究肺與大腸的相關性［J］.中醫(yī)雜志，2011，52（10）：865－867.

［9］ 范蕓，常乃柏，胡云建.血液病真菌感染的臨床分析［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2004，14（9）：1004－1005.

［10］ 玉芳，何佩貞，吳闖，等.32例醫(yī)院真菌感染臨床分析［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2002，12（2）：125－126.

［11］ 王付彬.真菌性腸炎198例臨床分析［J］.中國全科醫(yī)學，2005，8（6）：494.

［12］ 建平，張翊.醫(yī)院內(nèi)真菌感染臨床分析［J］.中華醫(yī)院感染學雜志，2004，14（3）：344.

［13］ 孫自勤，劉曉峰.腸道病學［M］.2版.濟南：山東科技出版社，2003：802－803.