竹纖維提取物體外抗菌活性及提取方法的研究

阮祥春，黃媛媛，趙德學，曾明華

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

竹纖維提取物體外抗菌活性及提取方法的研究

阮祥春，黃媛媛，趙德學，曾明華

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

【目的】 研究并明確毛竹纖維提取物的體外抗菌活性及其最佳提取方法。【方法】 將毛竹纖維粉碎成粉末后，分別用水、乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑，按照1∶5和1∶10料液比(m∶V)分別提取1，2，4 h，采用瓊脂擴散法觀察比較不同提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，用倍比稀釋法測定采用最佳提取方法得到的毛竹纖維提取物的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最低有效質(zhì)量濃度(MBC)?！窘Y(jié)果】 毛竹纖維水提取物對3種細菌幾乎無抑制作用；乙醇提取物僅對金黃色葡萄球菌有抑制作用，對其他2種細菌無明顯抑制作用；乙酸乙酯提取物對3種細菌均有較強抑制作用。由此確定竹纖維提取物的最佳提取方法為：用乙酸乙酯作為提取溶劑，料液比(m∶V)為1∶5，提取時間為4 h，在此條件下得到的毛竹纖維乙酸乙酯提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.125,0.125,0.062 5 mg/mL；最低有效質(zhì)量濃度分別為0.500,0.500,0.125 mg/mL?！窘Y(jié)論】 毛竹纖維在料液比為1∶5時提取4 h的乙酸乙酯提取物的抑菌活性最強。

竹纖維；提取方法；抗菌活性；瓊脂擴散法

毛竹廣泛分布在世界溫帶與亞熱帶地區(qū)。近期研究發(fā)現(xiàn)，竹的提取物含有很多生物活性物質(zhì)，如竹葉黃酮、多糖和氨基酸等[1]，具有抗菌活性、抗氧化性和抗炎癥等作用。

據(jù)Tanaka等[2]報道，竹筍皮的二氯甲烷提取物對金黃色葡萄球菌具有抗菌活性。Chen等[3]發(fā)現(xiàn)，用含0.3 g/kg竹粉末提取物的飼料喂雞1周后，其體質(zhì)量較對照組明顯增加，且在冷應激情況下具有防止雞體質(zhì)量降低的作用。Wang等[4]報道，將竹醋添加到仔豬日糧中，可以影響腸道的菌群改變，具有同添加抗生素類似的效果，有利于仔豬生長。賈若愚等[5]發(fā)現(xiàn)，在中國荷斯坦奶牛日糧中添加適量的竹提取物后，可以有效提高奶牛產(chǎn)奶量, 改善乳品質(zhì),優(yōu)化奶牛體內(nèi)的物質(zhì)代謝。因此，根據(jù)竹提取物具有抗菌活性和抗炎癥作用，可以將其用于開發(fā)雞、豬、牛等飼料的添加劑。

關于竹提取物的活性研究已經(jīng)較多的報道，主要集中在水、醇和有機溶劑提取方面[6-7]。隨著制造技術的發(fā)展，也出現(xiàn)了更為先進的提取技術，如超臨界CO2萃取法、超聲波提取和微波提取[8-9]等，但是這些技術目前還不能大規(guī)模應用于生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本較高。另外，在采用不同提取方法時，提取物的生物活性種類、含量都有很大差別，即使采用相同的微波技術提取竹葉，溶劑的不同提取出的竹葉活性成分也有差異[10]。

本研究分析了竹纖維水、乙醇和乙酸乙酯提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，以期探索毛竹纖維提取物的抗菌活性并篩選簡便易行的最佳提取方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料及菌種 毛竹纖維，收集于安徽安慶竹加工企業(yè)的毛竹纖維廢料；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,簡寫S.saureus,編號CMCC 26003)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,簡寫B(tài).subtilis,編號CMCC 63501)、大腸埃希菌(Escherichiacoli,簡寫E.coli,編號CMCC 44102),均由安徽省獸藥飼料監(jiān)察所贈送。

1.1.2 儀 器 數(shù)顯式恒溫水浴鍋，國華電器有限公司生產(chǎn)；循環(huán)水式真空泵，河南太康科教儀器廠生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海市亞榮實驗儀器廠生產(chǎn)。

1.1.3 試 劑 MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基，均購于北京奧博星生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 毛竹纖維的提取 將毛竹纖維廢料干燥后，粉碎成粉末。取100 g毛竹纖維粉末分別浸泡在含5倍和10倍體積(即料液比(m/V)為1∶5和1∶10)的水、乙醇、乙酸乙酯的圓底燒瓶中1 h。以水為提取溶劑時，加熱煮沸提取1，2，4 h，以乙醇、乙酸乙酯分別為提取溶劑時，加熱回流提取1，2，4 h。將所獲得的提取液分別用定性濾紙進行抽濾過濾，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至相當于含生藥質(zhì)量濃度為1 mg/mL，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備及抑菌圈的測定 將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種細菌接種到配制好后的肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12～16 h，然后稀釋到5×107mL-1。

將100 μL的菌液加到配制好后的瓊脂固體培養(yǎng)基表面，用玻棒涂勻，放置牛津杯，往牛津杯中加入各提取物，培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄各抑菌圈的直徑，比較篩選最佳的提取方法。

1.2.3 最佳提取方法下毛竹纖維提取物最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)的測定 采用倍比稀釋法測定MIC。取3組試管，每組13個。第1組試管均加入2 mL滅菌的肉湯培養(yǎng)基，先將2 mL 1 mg/mL的竹纖維提取液加入到1號試管中，然后從1號試管中吸取2 mL加入到含有2 mL肉湯的2號試管中，以此類推，一直到11號試管；然后在1～12號試管中分別接種大腸埃希菌菌液20 μL,13號試管不接種菌液，將12，13號試管作為對照。第2，3組試管按同樣方法分別接種金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌菌液。然后將各試管均于37 ℃培養(yǎng)18～24 h。與對照組相比，有絮狀沉淀的試管為有細菌生長，無絮狀沉淀的試管表明細菌生長受到抑制，肉眼觀察的無絮狀沉淀試管的最低藥物質(zhì)量濃度，即為最佳提取方法下毛竹纖維提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)。

1.2.4 最佳提取方法下毛竹纖維提取物最低有效質(zhì)量濃度(MBC)的測定 測定MIC后，再依次從未見細菌生長的各試管培養(yǎng)物中取一接種環(huán)菌液，接種于普通瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察有無細菌生長。在普通瓊脂平板中，生長菌落數(shù)小于5個時對應的藥液最低質(zhì)量濃度，即為最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.5 數(shù)據(jù)的處理 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛竹纖維水提取物對3種細菌的抑菌作用

表1顯示，以水為提取溶劑時，在相同料液比和浸泡提取時間下，所得毛竹纖維水提取物對3種細菌的抑菌作用差異不明顯；在不同料液比和提取時間下提取的毛竹纖維水提取物對同一種細菌的抑菌作用差異也不顯著(P>0.05)。

表1 毛竹纖維水提取物對3種細菌的抑菌作用Table 1 Inhibition effect of bamboo fiber water extracts against three bacteria

注：* 同行數(shù)據(jù)后標不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)， 標不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)。表2，3同。

Note:Different lowercase letters mean significantly difference (P<0.05),and different capital letters mean extremely significant difference (P<0.01).The same for table 2,3.

2.2 毛竹纖維乙醇提取物對3種細菌的抑菌作用

表2顯示，在相同料液比和提取時間下，毛竹纖維乙醇提取物對金黃色葡萄球菌具有極顯著的抑菌作用 (P<0.01)，而對大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌均無明顯抑菌作用。對同一種細菌而言，不同的料液比和提取時間的毛竹纖維乙醇提取物之間抑菌作用差異不顯著(P>0.05)。

表2 毛竹纖維乙醇提取物對3種細菌的抑菌作用Table 2 Inhibition effect of bamboo fiber ethanol extracts against three bacteria

2.3 毛竹纖維乙酸乙酯提取物對3種細菌的抑菌作用

表3顯示，毛竹纖維乙酸乙酯提取物對3種細菌都有較強的抑制作用。 對大腸埃希菌而言，在 1∶5 料液比下，不同提取時間得到的提取物的抑菌作用無明顯差異(P>0.05)；在1∶10料液比下，提取4 h得到的提取物對大腸埃希菌的抑菌活性極顯著增強(P<0.01)。對金黃色葡萄球菌而言，1∶5和1∶10的料液比條件下，提取2 h得到的提取物與1，4 h得到的提取物的抑菌活性有顯著差異(P<0.05)。對枯草芽孢桿菌而言，在1∶5料液比下，提取4 h的提取物與提取1，2 h的提取物的抑菌活性有極顯著差異(P<0.01)；在1∶10料液比下，提取2 h得到的提取物與1，4 h提取物有顯著差異(P<0.05)?？傮w而言，當料液比為1∶5或者1∶10、提取時間為4 h時，毛竹纖維乙酸乙酯提取物的抑菌活性最高。從實際生產(chǎn)考慮，料液比以1∶5為宜，不僅能節(jié)省提取溶劑使用量，還可減少能源的損耗。

由以上研究結(jié)果可知，在相同料液比和提取時間下，毛竹纖維乙酸乙酯提取物對供試3種細菌的抑制作用明顯高于水和乙醇提取物，可知乙酸乙酯是毛竹纖維的最佳提取溶劑，用其提取時的最佳料液比為1∶5，提取時間為4 h。

表3 毛竹纖維乙酸乙酯提取物對3種細菌的抑菌作用Table 3 Inhibition effect of bamboo fiber ethyl acetate extracts against three bacteria

2.4 毛竹纖維乙酸乙酯提取物的MIC,MBC測定

鑒于料液比為1∶5、提取時間為4 h時，毛竹纖維乙酸乙酯提取物對3種細菌具有較強的抑制作用，故測定其對3種細菌的MIC、MBC。測定結(jié)果(表4)顯示，其對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC和MBC分別為0.125,0.125,0.062 5 mg/mL和0.500,0.500,0.125 mg/mL。

表4 毛竹纖維乙酸乙酯提取物對3種細菌的MIC和 MBC值Table 4 MIC and MBC values of bamboo fiber ethyl acetate extracts against three bacteria mg/mL

3 討 論

竹提取物中含有多種活性物質(zhì)，具有抗氧化性、抗細菌、抗真菌及抗植物害蟲等多方面的作用[11]。操海群等[12-13]報道,毛金竹、白紋短穗竹、苦竹、巨縣苦竹乙醚提取物對蘿卜蚜具有拒食活性和觸殺作用，同時竹提取物可以激活棉鈴蟲中腸蛋白酶和淀粉酶的活性，降低羧酸酯酶的活性從而抑制棉鈴蟲幼蟲的發(fā)育。據(jù)報道，Sasaborealis竹的水提取物中可能含有治療或抑制糖尿病的肺泡表皮功能障礙及其相關并發(fā)癥的成分[14]。同時，竹衍生熱裂解產(chǎn)物對N-甲基天冬氨酸誘導的皮質(zhì)神經(jīng)元初級培養(yǎng)物的細胞死亡具有保護和抗纖溶酶作用[15]。

本試驗結(jié)果表明，采用不同溶劑提取的毛竹纖維提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3種細菌具有不同的抗菌活性：毛竹纖維的水提取物對3種細菌幾乎無抑菌作用；乙醇提取物只對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，而對大腸埃希菌和枯草芽孢桿菌無明顯抑菌活性；乙酸乙酯提取物對3種細菌都有較強的抑制作用。這與陳杰等[16]報道的結(jié)果相一致。

本研究中，當提取溶劑為乙酸乙酯、料液比為1∶5、提取時間為4 h時，提取得到的竹纖維提取物對3種細菌具有較強的抗菌活性，故確定其為毛竹纖維的最佳提取方法，該方法簡便、易操作，而且乙酸乙酯可以回收，能進行反復利用，可節(jié)約大量的提取溶劑成本，這為將毛竹纖維及相似的固體毛竹廢物開發(fā)成天然飼料添加劑奠定了理論基礎。

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Extraction methods andinvitroantibacterial activity of bamboo (Phyllostachyspubescens) fiber extracts

RUAN Xiang-chun,HUANG Yuan-yuan,ZHAO De-xue,ZENG Ming-hua

(CollegeofAnimalSciencesandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Anhui,Hefei230036,China)

【Objective】 Theinvitroantibacterial activity of extracts from bamboo (Phyllostachyspubescens) fiber was investigated and the extract methods were optimized.【Method】 Bamboo fiber was powdered before being extracted with agents of water,ethanol and ethyl acetate,solid-liquid ratios of 1∶5 and 1∶10(m∶V),and extraction times of 1 h,2 h and 4 h,respectively.The agar diffusion method was used to estimate the inhibition of extracts againstEscherichiacoli(E.coli),Staphylococcusaureus(S.aureus) andBacillussubtilis(B.subtilis).The double tube dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) at the obtained optimal conditions.【Result】 The water extract of bamboo fiber had little inhibition effect on three bacteria,the ethanol extract only had inhibition effect onStaphylococcusaureus,while the ethyl acetate extract had strong antibacterial activity against all 3 tested bacteria.The optimal extract method was using ethyl acetate with solid-liquid ratio of 1∶5 for 4 h.Under optimal conditions,the MIC of bamboo fiber extract againstEscherichiacoli(E.coli),Staphylococcusaureus(S.aureus) andBacillussubtiliswere 0.125,0.125,and 0.062 5 mg/mL,and the MBC were 0.500,0.500,and 0.125 mg/mL,respectively.【Conclusion】 The ethyl acetate extract of bamboo fiber with solid-liquid ratio of 1∶5 for 4 h had the strongest inhibition effect against tested bacteria.

bamboo fiber;extract method;antibacterial activity;double tube dilution method

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.020

2014-03-26

安徽省高校自然科學基金項目“毛竹廢棄物提取方法的研究”(2010)

阮祥春(1980-),男，安徽無為人，實驗師，在職博士，主要從事飼料添加劑、動物源性食品安全研究。 E-mail:rxc@ahau.edu.cn

曾明華(1956-)，男，安徽金寨人，副教授，主要從事動物源性食品安全研究。E-mail:zmhzmh@ahau.edu.cn

S795.08；S482.2+92

A

1671-9387(2015)11-0134-05

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.040.html