CO2氣調(diào)對煙草甲的毒力作用及其能源物質(zhì)的含量和利用率

曹 宇，楊文佳，孟永祿，劉 燕，熊正利，曾 力，李 燦

(貴陽學院 生物與環(huán)境工程學院，有害生物控制與資源利用貴州省高校特色重點實驗室，貴州 貴陽 550005)

CO2氣調(diào)對煙草甲的毒力作用及其能源物質(zhì)的含量和利用率

曹 宇，楊文佳，孟永祿，劉 燕，熊正利，曾 力，李 燦

(貴陽學院 生物與環(huán)境工程學院，有害生物控制與資源利用貴州省高校特色重點實驗室，貴州 貴陽 550005)

【目的】 研究CO2氣調(diào)對煙草甲的毒力作用，以及在CO2致死作用下煙草甲體內(nèi)能源物質(zhì)的含量和利用情況，為從生理生化角度探討CO2氣調(diào)的作用機制提供參考?！痉椒ā?試驗在溫度(25±1) ℃、濕度(70±5)%的條件下進行。CO2氣調(diào)水平設置10%，30%，50%，70%和90% 5個梯度，每隔3 h觀察其對煙草甲的致死情況。另外，不同氣調(diào)致死后，采用相關的化學方法測定煙草甲體內(nèi)多糖、可溶性蛋白質(zhì)及脂肪的含量，計算其利用率?！窘Y果】 隨著CO2水平的升高，其對煙草甲的毒力增強，10% CO2水平下，LT50和LT99(50%、99%煙草甲死亡所需時間)分別為23.21和128.06 h；90% CO2水平下，分別為7.26和19.25 h。隨著CO2氣調(diào)水平的升高，煙草甲體內(nèi)多糖、可溶性蛋白質(zhì)和脂肪等能源物質(zhì)的含量顯著增加，但均顯著低于對照，且對3種能源物質(zhì)的利用率均顯著降低；同一CO2水平下，煙草甲對3種能源物質(zhì)的利用率均具有顯著差異，其大小順序為脂肪>多糖>可溶性蛋白質(zhì)?！窘Y論】 CO2水平越高，對煙草甲的毒力作用越強；高CO2水平致死作用下，煙草甲對能源物質(zhì)的利用率顯著降低，脂肪是煙草甲應對氣調(diào)脅迫的主要能源物質(zhì)。

CO2氣調(diào)；煙草甲；能源物質(zhì)；多糖；可溶性蛋白質(zhì)；脂肪

煙草甲(Lasiodermaserricorne(Fabricius))是世界性分布的儲藏物害蟲，在許多國家和地區(qū)暴發(fā)危害[1-3]，對許多經(jīng)濟儲藏物造成重大損失，引起人們高度重視[4]。目前主要以化學藥劑熏蒸防治煙草甲，但由于化學藥劑對環(huán)境、儲藏物和人畜安全等的危害及害蟲抗性等問題日益突出[5-6]，迫切需要研發(fā)新的儲藏害蟲防治措施[7]。CO2氣調(diào)技術被公認為一種有效、安全、無殘留的儲藏物害蟲防治措施，在許多倉儲害蟲防治上有過報道[2]。低氧氣調(diào)對煙草甲敏感性的研究也有過報道[8-9]，Gunasekaran等[10]研究了不同CO2濃度脅迫一定時間對煙草甲的致死情況。但目前并無CO2對煙草甲毒力作用的系統(tǒng)研究。

昆蟲體內(nèi)的能源物質(zhì)對于其克服逆境脅迫有重要作用，如嗜卷書虱(Liposcelisbostrychophilus)和嗜蟲書虱(Liposcelisentomophila)體內(nèi)多糖、可溶性蛋白質(zhì)及甘油三酯的不同代謝，可助其應對不同的化學藥劑脅迫[11]；嗜卷書虱對甘油三酯的消耗與其對CO2的抗性密切相關[12]；而蛋白質(zhì)、總糖及脂肪等能源物質(zhì)的變化對于煙蚜繭蜂(Aphidiusgifuensis)抵抗低溫有積極作用[13]。但目前尚未見關于CO2對煙草甲生理生化特性影響的研究報道。因此，本試驗研究了CO2氣調(diào)對煙草甲的毒力作用，并研究其致死作用下煙草甲體內(nèi)能源物質(zhì)含量和利用的影響，以期在一定程度上探討CO2氣調(diào)的控害機制，為煙草甲的綠色可持續(xù)治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

煙草甲采自貴陽市藥材公司藥材上，在人工氣候箱內(nèi)，于溫度(25±1) ℃、相對濕度(75±5)%、光照L/D=14 h/10 h、光照強度4 000 lx的條件下飼養(yǎng)，以中藥材甘遂(Euphorbiakansui)(購自貴陽市藥材公司)為飼料。人工飼養(yǎng)5代以上，以羽化2～3 d的成蟲為試蟲。

1.2 主要試劑與儀器設備

氣體CO2(純度高于99%)購于貴陽當?shù)貧怏w供應站；蒽酮(Anthrone)為天津市科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍G-250(Coomassie brilliantblue G-250)、牛血清白蛋白(ABS，Albumin bovine serum)均為Sigma公司產(chǎn)品。

高速冷凍離心機(Allegra X-30 Series Centrifuges)，Beckman Coulter公司生產(chǎn)；754PC紫外-可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn)；自動雙純水系統(tǒng)(KL-RO-20)，唐氏康寧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；BSA124S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司生產(chǎn)；氣調(diào)混配器QT-MIX，長沙長錦科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CO2氣調(diào)對煙草甲的毒力作用 采用課題組前期氣調(diào)處理方法[2]，取煙草甲成蟲60頭放入培養(yǎng)盒，加入30 g甘遂作為飼料，加蓋密閉，通過氣調(diào)混配器，用導管通入設定濃度的CO2氣體，待CO2濃度配比達到要求后停止通氣。將培養(yǎng)盒的進出氣口導管對接后放入人工氣候箱培養(yǎng)觀察，相對濕度(70±5)%，溫度(25±1) ℃，每隔3 h觀察記錄試蟲存活情況。昆蟲死亡確定標準：將試蟲移出處理環(huán)境5 h后，以毛筆刺激，不動視為死亡。CO2氣調(diào)設置為10%，30%，50%，70%，90% 5個處理，相同條件下空氣處理作為對照，重復3次，以Abbott公式校正死亡率。

1.3.2 多糖含量的測定 參考程偉霞等[11]的蒽酮比色法，分別挑取不同CO2氣調(diào)水平下致死的煙草甲30頭，充分勻漿后，于15 000 r/min、25 ℃下離心10 min，取其上清液加入質(zhì)量分數(shù)0.2%蒽酮試劑，混合均勻后沸水浴10 min，于620 nm處測定其OD值。根據(jù)葡萄糖標準曲線[11]，將測定結果換算成μg/頭。試驗重復3次。相同條件下自然生長的活體煙草甲體內(nèi)多糖含量作為對照，計算不同CO2水平致死情況下，煙草甲對多糖的利用率[12]。多糖利用率=(對照含量-氣調(diào)致死下含量)/對照含量×100%。

1.3.3 可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 采取Bradford[14]、程偉霞等[11]的考馬斯亮藍G-250法，分別挑取不同CO2氣調(diào)水平作用致死的煙草甲30頭，加入pH 7.0、0.04 mol/L的磷酸緩沖液3 mL于冰水浴中勻漿，勻漿液于10 000g、4 ℃離心15 min，取其上清液加入質(zhì)量分數(shù)1%考馬斯亮藍G-250反應，在595 nm處測定其OD值。以牛血清白蛋白標準曲線[11]，將測定結果轉換成μg/頭，試驗重復3次，以相同條件下自然生長的活體煙草甲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量作為對照，計算不同CO2水平致死情況下，煙草甲對可溶性蛋白質(zhì)的利用率。可溶性蛋白質(zhì)的利用率=(對照含量-氣調(diào)致死下含量)/對照含量×100%。

1.3.4 脂肪含量的測定 參照Colinet等[15]的昆蟲脂肪測定方法，分別將不同CO2氣調(diào)處理后的煙草甲30頭置于 60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，干燥 48 h后稱蟲體干質(zhì)量(dry mass,DM)。取干燥后的成蟲于玻璃勻漿器中加入6 mL氯仿和甲醇提取液(V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1)研磨勻漿，轉移至離心管中4 ℃下以4 500 r/min離心20 min。轉移上清液, 沉淀中再加入氯仿和甲醇提取液, 再次離心。轉移上清后剩余沉淀在 60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥24 h至恒質(zhì)量(lean dry mass,LDM)。則脂肪含量(lipid content,LC)=DM-LDM。試驗重復3次，以自然條件下的煙草甲脂肪含量作為對照，計算不同CO2水平致死情況下，煙草甲對脂肪的利用率。脂肪利用率=(對照含量-氣調(diào)致死下含量)/對照含量×100%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 18.0軟件處理所測數(shù)據(jù)，采用Duncan氏新復極差檢測法比較各處理下煙草甲多糖、可溶性蛋白質(zhì)、脂肪含量及利用率的差異情況。

2 結果與分析

2.1 不同CO2氣調(diào)對煙草甲的毒力作用

隨著CO2氣調(diào)水平的升高，煙草甲毒力回歸曲線的斜率逐漸增大，表明高水平的CO2對煙草甲的毒力較強(表1)。在10%，30%，50%，70%，90%的CO2作用下，其LT50分別為23.21，9.96，7.90，7.71和7.26 h；LT99分別為128.06，39.60，31.86，28.58和19.25 h。說明隨著CO2氣調(diào)水平升高，煙草甲的LT50、LT99都逐漸縮短，對煙草甲的控制效果越來越好。

表1 不同CO2氣調(diào)對煙草甲的毒力作用Table 1 Toxicity of different CO2 concentrations to Lasioderma serricorne

注：*LT50、LT99分別表示CO2氣調(diào)作用下，50%、99%煙草甲死亡所需時間。

Note:LT50and LT99were the hours needed for 50% and 99%Lasiodermaserricornedied under CO2exposure.

2.2 CO2氣調(diào)對煙草甲能源物質(zhì)含量的影響

CO2氣調(diào)對煙草甲體內(nèi)多糖、可溶性蛋白及脂肪含量的影響見表2。

表2 不同CO2氣調(diào)作用下煙草甲體內(nèi)的能源物質(zhì)含量 Table 2 Contents of energy substances in Lasioderma serricorne under different CO2 exposures μg/頭

注：*表中數(shù)據(jù)為“平均數(shù)±標準誤”，同列數(shù)據(jù)后標不同小寫字母表示不同處理之間差異達到顯著水平(P<0.05)。

Note:Data are “mean±SE”.Different lowercase letters in each column indicate significant difference(P<0.05).

由表2可知，自然條件下，煙草甲體內(nèi)多糖、可溶性蛋白質(zhì)及脂肪含量分別為15.67，139.51和44.74 μg/頭。不同CO2氣調(diào)致死后，煙草甲體內(nèi)能源物質(zhì)的含量較對照均顯著下降(P<0.05)。CO2氣調(diào)各處理之間相比，隨著CO2水平的升高，其含量顯著增加。10% CO2作用下，煙草甲體內(nèi)多糖、可溶性蛋白質(zhì)及脂肪含量分別為5.79，74.80和14.89 μg/頭，分別為對照的36.95%，53.62%和33.28%；而90% CO2作用后，其含量分別為9.56，95.88和23.57 μg/頭，為對照的61.01%，68.73%和52.68%。

2.3 CO2氣調(diào)對煙草甲能源物質(zhì)利用率的影響

2.3.1 煙草甲對同一能源物質(zhì)的利用率 不同CO2氣調(diào)致死后，煙草甲對多糖、可溶性蛋白質(zhì)及脂肪3種能源物質(zhì)具有相似的利用規(guī)律(圖1)，即均隨著CO2氣調(diào)水平升高，利用率逐漸降低，且不同水平之間差異顯著。

圖1 不同CO2氣調(diào)作用下煙草甲對多糖、可溶性蛋白質(zhì)和脂肪的利用率柱上不同小寫字母表示不同CO2處理之間差異顯著(P<0.05)

2.3.2 相同CO2氣調(diào)水平對煙草甲不同能源物質(zhì)利用率的影響 盡管煙草甲對多糖、可溶性蛋白質(zhì)和脂肪3種能源物質(zhì)的利用率均隨CO2氣調(diào)水平的升高而顯著降低，但其對三者的利用程度不同。比較分析表明，所有氣調(diào)處理下，煙草甲對三者的利用率均表現(xiàn)為脂肪>多糖>可溶性蛋白質(zhì)，且三者之間差異顯著(圖2)。說明脂肪是煙草甲應對氣調(diào)脅迫的主要能源物質(zhì)，其次為多糖、可溶性蛋白質(zhì)。

3 討 論

CO2氣調(diào)對粉斑螟蛾(Ephestiacautella)、谷象(Sitophilusgranarius)、米象(Sitophilusoryzae)和谷斑皮蠹(Trogodermagranarium)的控制研究均有報道[16]。Bailey等[17]提出，當CO2濃度達到60%時，能較好地控制倉儲害蟲的危害；Jay等[18]進一步補充，60% CO2處理48 h能殺死大部分害蟲及其子代。本研究表明，隨著CO2水平的升高，煙草甲LT50、LT99值越小，表明CO2水平越高對煙草甲的控制效果越好。其中70%CO2水平脅迫28.58 h后，可引起99%的煙草甲死亡，相關報道表明70% CO2脅迫48 h后，可導致全部供試煙草甲死亡[10]。

圖2 CO2氣調(diào)作用后煙草甲對不同能源物質(zhì)利用率的比較不同小寫字母表示同一CO2水平處理下差異顯著(P<0.05)

昆蟲體內(nèi)的能源物質(zhì)在其應對逆境脅迫中發(fā)揮積極作用[12,19]，本研究中，與對照相比，CO2氣調(diào)致死作用下，煙草甲體內(nèi)多糖、可溶性蛋白質(zhì)及脂肪3種能源物質(zhì)均顯著下降，CO2氣調(diào)脅迫導致煙草甲能源物質(zhì)的大量消耗，可能是引起其死亡的重要因素，這與對嗜卷書虱等害蟲的報道結果[12]類似；隨著CO2氣調(diào)水平的升高，煙草甲對能源物質(zhì)的利用率則顯著降低，這可能是因為，在較高的CO2水平作用下，煙草甲過早昏迷或死亡，進而減少了其對能源物質(zhì)的消耗。相同CO2水平下，煙草甲對三者的利用率具有顯著差異，利用率大小順序為脂肪>多糖>可溶性蛋白質(zhì)，說明脂肪是煙草甲應對氣調(diào)脅迫的主要能源物質(zhì)。研究表明，脂類化合物在赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)抗氣性品系應對氣調(diào)脅迫中起著重要作用[19]，因此，推測煙草甲對脂肪的高利用率，可能與其抗氣性的形成密切相關。

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Toxicity of CO2toOryzaephilussurinamensisand content and utilization of its energy substances

CAO Yu,YANG Wen-jia,MENG Yong-lu,LIU Yan,XIONG Zheng-li,ZENG Li,LI Can

(Key&SpecialLaboratoryofGuizhouHighCollegeforPestControlandResourceUtilization,CollegeofBiologyandEngineeringofEnvironment,GuiyangUniversity,Guiyang,Guizhou550005,China)

【Objective】 This paper discussed the toxicity of different CO2concentrations toLasiodermaserricorneand the content and utilization of energy substances (polysaccharides,soluble protein and lipid) inL.serricorneto explore the control mechanism of CO2toL.serricorneat physiological and biochemical level.【Method】 The experiment was conducted at constant temperature of (25±1) ℃ and relative humidity of (75±5)%.L.serricornewere exposed to different CO2concentrations (10%,30%,50%,70% and 90%) to observe its mortality every 3 hours until all the insects were dead.In addition,the contents of polysaccharide,soluble protein and lipid inL.serricornewere determined by related biochemistry methods after death and their utilization rates were calculated.【Result】 The toxicity toL.serricorneincreased as the increase of CO2concentration.The LT50and LT99were 23.21 h and 128.06 h under 10% CO2and they decreased to 7.26 and 19.25 h under 90% CO2.The contents of energy substances inL.serricorneincreased significantly with the increase of CO2concentration,but all were significantly lower than in control.There were significant differences in the utilization of the three energy substances under the same CO2concentration,the utilization rates were in a decreasing order of lipid>polysaccharide>soluble protein.【Conclusion】 The toxicity toL.serricorneincreased as the increase of CO2concentration.The utilization rates of energy substances were significantly decreased by high CO2concentration,and lipid was the main energy source in response to CO2exposure.

CO2control atmosphere;Lasiodermaserricorne;energy substance;polysaccharides;soluble protein;lipid

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.018

2015-04-15

貴州省國際合作項目(黔科合外G字[2013]7047號)；貴州省高校特色重點實驗室建設項目(黔教合KY字[2012]013)；貴州省重點學科項目(黔學位合字ZDXK[2013]08)

曹 宇(1984-)，男，四川自貢人，實驗師，在讀博士，主要從事昆蟲生態(tài)與綜合治理研究。 E-mail：yucaosuccess@126.com

李 燦(1979-)，男，貴州盤縣人，教授，博士，主要從事有害生物控制與資源利用研究。E-mail：lican790108@163.com

S433.5

A

1671-9387(2015)11-0123-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.036.html