毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程的相關性

張 妍，崔彬彬，魏俊杰，朱維紅，張 穎,2

(1 保定學院 生化系，河北 保定 071000；2 北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院，北京 100083)

毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程的相關性

張 妍1，崔彬彬1，魏俊杰1，朱維紅1，張 穎1,2

(1 保定學院 生化系，河北 保定 071000；2 北京林業(yè)大學 生物科學與技術(shù)學院，北京 100083)

【目的】 對毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程的相關性進行研究，為毛白楊多倍體誘導提供細胞學理論基礎與技術(shù)支持?！痉椒ā?2014-01采集毛白楊雌、雄花枝于溫室水培，自水培46 h開始每隔2～3 h取雌、雄花芽樣品，采用石蠟切片和醋酸洋紅壓片技術(shù)對毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程及其對應關系進行觀察研究?！窘Y(jié)果】 毛白楊小孢子母細胞在水培52 h開始減數(shù)分裂，發(fā)育到雙核花粉粒共歷時約10 d；大孢子母細胞在水培118 h開始減數(shù)分裂，發(fā)育至二核胚囊期共歷時約13 d。毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂的進程以及與雌、雄花芽外部形態(tài)的變化之間均存在一定的相關性，在水培118 h毛白楊大孢子母細胞開始減數(shù)分裂進入細線期時，其小孢子母細胞減數(shù)分裂至四分體時期，此時雌花序微微露出芽鱗，雄花序1/4以上伸出芽鱗，花藥呈塊狀微紅色；在水培144 h大孢子母細胞減數(shù)分裂發(fā)育到粗線期時，其小孢子母細胞大多已發(fā)育至單核期，此時雌花序1/5伸出芽鱗，雄花序1/3以上伸出芽鱗，花藥呈塊狀淺紅色；在水培237 h大孢子母細胞減數(shù)分裂發(fā)育到中期Ⅰ時，其小孢子母細胞已發(fā)育至雙核期，此時雌花序1/3伸出芽鱗，雄花序1/2以上伸出芽鱗，花藥呈塊狀紅色。【結(jié)論】 根據(jù)大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程的時序相關性，通過觀察相同培養(yǎng)條件下小孢子母細胞減數(shù)分裂的時期，可即時判別大孢子母細胞的減數(shù)分裂進程；還可從花芽長度、花藥顏色等來估計大、小孢子母細胞減數(shù)分裂所處的時期。

毛白楊；大孢子；小孢子；減數(shù)分裂

毛白楊(PopulustomentosaCarr.)是我國特有的白楊派樹種，具有適應性強、早期速生以及無性繁殖容易等特點，因而可以迅速成林，并在短期內(nèi)提供木材。而三倍體毛白楊更是具有生長迅速、葉大、抗鹽性強等優(yōu)勢。近年來，我國廣泛栽培的‘I-214’、‘中林46’、‘沙蘭楊’、‘武黑1號’、‘遼河楊’、‘廊坊三號’、‘銀中楊’等著名楊樹品種相繼被證明是三倍體[1-3]。三倍體毛白楊的成功培育，創(chuàng)造了可觀的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益。因此，人工誘導楊樹多倍體育種顯得尤為重要。但是，在利用誘導花粉染色體加倍選育白楊三倍體的研究中，由于2n花粉存在競爭力差等問題，造成三倍體得率較低[4]。若誘導雌配子加倍并授以正?；ǚ奂纯?00%獲得三倍體[5]。然而，與誘導小孢子加倍相比，雌配子發(fā)育時期不易判別，難以準確把握加倍處理的最佳時期。目前，針對大孢子母細胞的加倍處理主要是通過對大量材料進行處理及篩選，不僅工作量大，三倍體得率也很低，且重復性差，因而限制了2n雌配子誘導及其育種應用[6]。若采用雌、雄配子體發(fā)育時期對照的方法可解決雌配子染色體加倍時期不易判別的問題[7-10]。目前針對白楊派樹種銀腺楊、響葉楊等大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程相關性的研究較多，也較為系統(tǒng)[11-12]，而毛白楊在此方面的研究尚未見報道。為此，本試驗就毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程及其對應關系進行了研究，以期為毛白楊多倍體誘導提供細胞學理論基礎與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

2014-01于山東冠縣苗圃采集花芽飽滿、無病蟲害、健壯的毛白楊雌、雄花枝，采集時注意雌、雄株的生活環(huán)境及枝條采集部位的一致性，用塑料薄膜包裹花枝運至河北大學溫室，避風低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

將毛白楊雌、雄花枝在溫室內(nèi)進行切枝水培，溫度保持在10～25 ℃，并注意培養(yǎng)條件相同；水培46 h后開始進行花芽固定，每隔2～3 h分別采集2個雌、雄花芽并去除底部鱗片，雄花芽用卡諾固定液、雌花芽用FAA固定液進行固定，共歷時340 h；于4 ℃條件下低溫保存固定好的雌雄花芽。小孢子母細胞減數(shù)分裂及雄配子發(fā)育的觀察采用醋酸洋紅壓片法，大孢子母細胞減數(shù)分裂及雌配子發(fā)育的觀察采用石蠟切片制片，切片厚度8 μm，蘇木精染色。用Olympus BX51型顯微鏡觀察并照相。由于毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂過程不同步，因而以大多數(shù)分裂相作為該發(fā)育階段的時期。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛白楊小孢子母細胞減數(shù)分裂進程

在溫室水培條件下，毛白楊小孢子母細胞由小孢子母細胞發(fā)育到雙核花粉粒共歷時約10 d。具體觀察結(jié)果如下：

(1)細線期。水培52 h，花序微露，花藥淡綠色，花芽長1.3～1.4 cm(圖1-A,B)；細胞核體積較大，染色體排列雜亂，呈細絲狀。此時小孢子母細胞減數(shù)分裂進入細線期(圖2-A)。

(2)細線末期。水培59 h，毛白楊雄花芽形態(tài)基本無變化，花芽長1.4～1.45 cm，小孢子母細胞減數(shù)分裂進入細線末期。染色體集中于核仁的一側(cè)，呈花束狀(圖2-B)。

(3)粗線期。水培67 h，花序約1/6伸出芽鱗，花藥頂端微紅，花芽長1.45～1.5 cm(圖1-C,D)。染色體較之前縮短變粗但仍然較長、形態(tài)略顯明顯但相互重疊纏繞，仍難以區(qū)分，同源染色體在此時期進行聯(lián)會(圖2-C)。

(4)雙線期。水培81 h，毛白楊小孢子母細胞減數(shù)分裂進入雙線期，花序1/5伸出芽鱗，花藥頂端出現(xiàn)點狀紅，花芽長約1.5 cm(圖1-E,F)。染色體明顯縮短變粗，聯(lián)會的同源染色體之間相互排斥，有交叉現(xiàn)象出現(xiàn)(圖2-D,E)。此時小孢子母細胞減數(shù)分裂不同步現(xiàn)象變得明顯。

(5)終變期。水培86 h，花芽無明顯變化。染色體螺旋化程度更深，其形態(tài)進一步縮短變粗，核仁變小甚至消失(圖2-F)。減數(shù)分裂進入終變期。

圖1 毛白楊雄花芽及其花藥發(fā)育進程A,B.花序微露的雄花芽及其花藥；C,D.1/6花序露出芽鱗的雄花芽及其花藥；E,F.1/5花序露出芽鱗的雄花芽及其花藥；G,H.1/4花序露出芽鱗的雄花芽及其花藥；I,J.1/3花序露出芽鱗的雄花芽及其花藥；K,L.1/2花序露出芽鱗的雄花芽及其花藥

(6)中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ。水培93 h，略大于1/5的花序伸出芽鱗，花藥頂端點狀紅向下延伸，花芽長度約1.6 cm。此時各分裂相富集，大部分為中期Ⅰ、后期Ⅰ和末期Ⅰ。減數(shù)分裂進入中期Ⅰ時，紡錘體形成，成對的染色體整齊排列在赤道板上，核膜、核仁消失(圖2-G)；減數(shù)分裂進入后期Ⅰ時，在紡錘絲的牽引下同源染色體分離并向兩極移動(圖2-H)；進入末期Ⅰ，移向兩極的染色體聚集在一起，纏繞成團狀呈二分體狀態(tài)，并且出現(xiàn)多核仁現(xiàn)象(圖2-I,J)。

(7)前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末期Ⅱ。水培105 h，減數(shù)分裂進入前期Ⅱ(圖2-K)；之后出現(xiàn)紡錘體，兩組染色體縮短變粗分別整齊排列在赤道板上，即為中期Ⅱ(圖2-L)；緊接著進入后期Ⅱ，著絲點分裂，姐妹染色單體分離，分別向兩極移動(圖2-M)；染色體到達兩極后染色體變?yōu)槿旧|(zhì)，核仁物質(zhì)聚集，進入末期Ⅱ(圖2-N,O,P)。這一時期的花芽變化不大，花序約1/4伸出芽鱗(圖1-G,H)。

圖2 毛白楊小孢子母細胞減數(shù)分裂及雄配子發(fā)育進程 A.細線期；B.細線末期；C.粗線期；D,E.雙線期；F.終變期；G.中期Ⅰ；H.后期Ⅰ；I,J.末期Ⅰ；K.前期Ⅱ；L.中期Ⅱ；M.后期Ⅱ；N-P.末期Ⅱ；Q,R.四分體；S.單核中期；T.單核靠邊期；U.雙核期
Fig.2 Microspore mother cell meiosis and male gamete development ofPopulustomentosaCarr.A.Leptotene;B.Late leptotene;C.Pachytene;D,E.Diplotene;F.Diakinesis;G.MetaphaseⅠ;H.AnaphaseⅠ;I,J.TelophaseⅠ;K.ProphaseⅡ;L.Metaphase Ⅱ;M.Anaphase Ⅱ;N-P.TelophaseⅡ;Q,R.Tetrad;S.Mononuclear mid;T.Mononuclear aside period;U.Binucleate

(8)四分體時期。水培至118 h時，毛白楊小孢子母細胞減數(shù)分裂基本完成，形成四分體(圖2-Q,R)。此時花序伸出芽鱗略大于1/4，花藥塊狀微紅，花芽長約1.7 cm。

(9)單核早期。水培136 h，胼胝質(zhì)溶解，由四分體形成4個小孢子，體積較小，細胞質(zhì)濃厚，核位于中央，為單核早期。花序伸出芽鱗約1/3，花藥塊狀微紅，花芽長約1.8 cm(圖1-I,J)。

(10)單核中期。水培144 h，花序伸出芽鱗略大于1/3，花藥塊狀淺紅，花芽長約1.9 cm。小孢子體積變大，細胞質(zhì)變稀薄，內(nèi)形成許多小液泡，形成花粉壁及萌發(fā)孔(圖2-S)。

(11)單核后期。水培201 h，許多小液泡聚集形成一個中央大液泡，因此核移向細胞的一側(cè)，又稱單核靠邊期(圖2-T)?；ㄐ蛏斐鲅亏[1/2，花藥塊狀紅，花芽明顯伸長，約2.1 cm(圖1-K,L)。

(12)雙核期。水培237 h，1/2以上花序伸出芽鱗，花藥塊狀紅，花芽長約2.3 cm。有絲分裂形成一大一小2個核，即營養(yǎng)核和生殖核，為雙核期(圖2-U)。

2.2 毛白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進程

毛白楊大孢子母細胞水培118 h后才開始進入減數(shù)分裂，發(fā)育至二核胚囊共歷時約13 d。觀察結(jié)果如下：

(1)細線期。水培118 h，花序微露，染色體明顯但排列無序，呈細絲狀。此時毛白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進入細線期(圖3-A)。

(2)細線末期。水培136 h，約1/6花序伸出芽鱗，染色體出現(xiàn)極化，集中于核仁一側(cè)，呈花束狀(圖3-B)，分裂進入細線末期。

(3)粗線期。水培144 h，花序約1/5伸出芽鱗，染色體縮短變粗，但仍較長，同源染色體聯(lián)會，形態(tài)明顯(圖3-C)。

(4)雙線期。水培201 h，花序伸出芽鱗1/4，染色體進一步縮短變粗，同源染色體相互排斥而分離(圖3-D)。

(5)中期Ⅰ。水培237 h，花序伸出芽鱗1/3，形成紡錘體，同源染色體對整齊排列在赤道板上，核膜、核仁消失(圖3-E)。水培至201 h時，觀察到部分大孢子母細胞已經(jīng)進入中期Ⅰ。

(6)二分體。水培261 h，略多于1/3的花序伸出芽鱗，第一次減數(shù)分裂完成，形成縱向排列的二分體(圖3-F)。

(7)四分體。水培279 h，花序伸出芽鱗1/2，減數(shù)分裂結(jié)束，形成直列式四分體(圖3-G)，即為4個大孢子。

(8)單核胚囊。水培300 h，花序伸出芽鱗2/3，靠近珠孔端的3個大孢子退化，合點端大孢子發(fā)育為功能大孢子，即形成單核胚囊(圖3-H)。

(9)二核胚囊。水培314 h，多于2/3的花序伸出芽鱗，功能大孢子進行一次有絲分裂，進入二核胚囊期(圖3-I)。

圖3 毛白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進程A.大孢子母細胞；B.細線末期；C.粗線期；D.雙線期；E.中期Ⅰ；F.二分體；G.四分體；H.單核期；I.雙核期

2.3 毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程的對應關系

通過觀察發(fā)現(xiàn)，在水培條件相同的情況下，毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程存在一定的時序相關性(表1)，而且大孢子母細胞減數(shù)分裂進程明顯滯后。花枝水培52 h，毛白楊小孢子母細胞開始進入減數(shù)分裂，花序微露；此時大孢子母細胞還未進入減數(shù)分裂。水培至118 h，毛白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進入細線期，雌花序微露；此時多于1/4雄花序伸出芽鱗，花藥微紅，小孢子母細胞進入四分體時期。水培136 h，雌花序1/6伸出芽鱗，大孢子母細胞進入細線末期；而雄花芽1/3花序伸出芽鱗，花藥塊狀微紅，雄配子發(fā)育至花粉粒單核早期。水培144 h，1/5雌花序伸出芽鱗，減數(shù)分裂進入粗線期；此時多于1/3雄花序伸出芽鱗，花藥塊狀淺紅，雄配子發(fā)育至花粉單核中期。水培201 h，雌花序1/4伸出芽鱗，大孢子母細胞減數(shù)分裂大多處于粗線期、雙線期和中期Ⅰ；雄花序1/2伸出芽鱗，花藥塊狀紅色，雄配子發(fā)育到花粉單核靠邊期。水培237 h，雌花序1/3伸出芽鱗，大孢子母細胞減數(shù)分裂多處于中期Ⅰ；雄配子發(fā)育到花粉雙核期，多于1/2花序伸出芽鱗，花藥呈塊狀紅色。

表1 毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程的對應關系Table 1 Corresponding relationships of the meiosis stages of MMC and PMC of Populus tomentosa Carr.

3 討論與結(jié)論

楊樹大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程存在一定的相關性，這在響葉楊、銀腺楊、毛新楊的研究中已經(jīng)得到證實[5,11-12]，毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程同樣存在一定的相關性。本研究結(jié)果表明，大孢子母細胞減數(shù)分裂進程明顯滯后于小孢子母細胞減數(shù)分裂。小孢子母細胞在水培52 h開始減數(shù)分裂進入細線期，而大孢子母細胞在水培118 h才開始減數(shù)分裂進入細線期，此時小孢子母細胞已經(jīng)發(fā)育至四分體時期；而大孢子母細胞進入中期Ⅰ時，雄配子已發(fā)育到了雙核期。因此，可以根據(jù)毛白楊大、小孢子發(fā)育的時序相關性，通過對相同培養(yǎng)條件下小孢子發(fā)育進程的觀察，對毛白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進程進行即時判別。

毛白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進程與其花芽的外部形態(tài)存在一定的相關性。當毛白楊雌花序微露，花序長1.8～2.5 cm時，大孢子母細胞減數(shù)分裂處于細線期和細線末期；而當花序1/3伸出鱗片，長3～4 cm時，大多進入中期Ⅰ。因此，可通過毛白楊雌花芽的外部形態(tài)對其減數(shù)分裂時期進行判斷。

毛白楊大、小孢子母細胞開始減數(shù)分裂進入細線期的間隔時間約66 h，在隨后的各發(fā)育階段大孢子母細胞用時均長于小孢子母細胞，毛白楊小孢子母細胞發(fā)育到雙核花粉粒共歷時約10 d；大孢子母細胞發(fā)育至二核胚囊期歷時約13 d。這與包括毛新楊、銀腺楊等在內(nèi)的幾個白楊派樹種相似，但也存在一定的差異，例如毛新楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進入細線期的間隔時間約61 h，而銀腺楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進入細線期的間隔則約需113 h[11]；當雄配子發(fā)育至雙核期時，毛白楊大孢子母細胞減數(shù)分裂進入中期Ⅰ，而銀腺楊則進入細線末期、粗線期、終變期等時期[11]。不同白楊的大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程存在差異，是由于植物種間遺傳特性的不同造成的，同時也不排除取樣時間、天氣狀況以及溫室條件等因素造成的差異。

大孢子母細胞減數(shù)分裂進程的即時判別是利用大孢子染色體加倍選育三倍體技術(shù)的關鍵。相關樹種研究表明,可利用雌、雄花芽發(fā)育進程的相關性，以雄配子發(fā)育進程為參照，來確定大孢子染色體加倍的有效處理時期[11-12]。在實際應用中,由于采樣母株的生長地區(qū)及生活環(huán)境不同、花枝采集時間及花芽發(fā)育時期不同、溫室培養(yǎng)條件不同等多方面因素的影響，大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程可能存在一定的差異。本研究結(jié)果表明，毛白楊大、小孢子母細胞減數(shù)分裂進程存在相關性，花芽外部形態(tài)與其減數(shù)分裂進程也存在相關性，可以通過臨時壓片觀察小孢子母細胞減數(shù)分裂，來即時判別大孢子母細胞減數(shù)分裂時期，同時結(jié)合花芽外部形態(tài)與其減數(shù)分裂進程的相關性進行綜合判斷，以降低外界因素的影響，可相對準確地確定大孢子染色體加倍的有效時期。此結(jié)果不僅在利用大孢子染色體加倍選育三倍體技術(shù)中具有實際應用價值，也為毛白楊三倍體等多倍體育種提供了細胞學理論基礎。

隨著2n雌配子誘導機制的不斷提高、授粉后染色體加倍誘導三倍體機理的揭示以及四倍體毛白楊誘導研究的不斷深入，將會培育出更加優(yōu)良的毛白楊樹種。

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Correlations between megasporocytes and microsporocytes meiosis stages ofPopulustomentosaCarr.

ZHANG Yan1,CUI Bin-bin1,WEI Jun-jie1,ZHU Wei-hong1,ZHANG Ying1,2

(1DepartmentofBiologyandChemistry，BaodingUniversity，Baoding，Hebei071000，China；2CollegeofBiologicalSciencesandTechnology，BeijingForestryUniversity，Beijing100083，China)

【Objective】 This study investigated the correlations in meiotic process ofPopulustomentosaCarr.megasporocytes and microsporocytes to provide cytological basis and technical support for polyploid hybrid breeding.【Method】 Flowering branches ofP.tomentosaCarr.planted in water in greenhouse were collected and flower buds were picked every two to three hours after being cultured in water for 46 hours.The mother cell meiosis stages and their corresponding relations between megasporocytes and microsporocytes ofP.tomentosaCarr.were studied using paraffin section method and acetic carmine squash technique.【Result】 After being cultured in water for 52 hours,microspore mother cells ofP.tomentosaCarr.started meiosis and it took 10 days for them to develop into binucleate pollen grains.Megaspore mother cells began meiosis after 118 hours and binucleate embryo sacs formed after 13 days.The meiosis stages and flower bud morphologies of megaspores and microspores closely related.After 118 hours in water,the meiosis of megaspore mother cells entered leptotene,while that of microspore mother cells developed into tetrads.Little female catkin and more than 1/4 of male catkin appeared and anthers appeared patches of slight redness.The meiosis of most megaspore mother cells developed into pachytene after 144 hours,and microspores developed into mononuclear.At the same time,1/5 of female catkin and more than 1/3 of male catkin extended and patches of pale redness appeared on anthers.When the meiosis of megasporocytes entered metaphase Ⅰ after 237 hours in water,the microsporocytes developed into binucleate.Meantime,1/3 of female catkin and more than 1/2 of male catkin extended and anthers had red patches.【Conclusion】 According to the relationship of female and male gametes,the meiosis stages of megasporocytes could be discriminated timely through observing the meiosis of microsporocytes under the same culture circumstances.In addition,the meiosis stages ofP.tomentosaCarr.megasporocytes and microsporocytes could be estimated based on flower bud morphology such as the length of the flower buds and the color of anther.

PopulustomentosaCarr.;megasporocyte;microsporocyte;meiosis

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.010

2015-05-22

河北省自然科學基金資助項目(C2013104053)；國家自然科學基金資助項目(31300562)；保定學院科研基金資助項目(2010Z02)；保定學院科研團隊項目(KYTD2013001)

張 妍(1966-)，女，河北保定人，講師，碩士，主要從事植物生理生化與生物技術(shù)研究。E-mail：1320450298@qq.com

崔彬彬(1975-)，女，河北保定人，副教授，博士，主要從事林木遺傳育種與生物技術(shù)研究。E-mail：cbb0508@163.com

S792.117

A

1671-9387(2015)11-0063-08

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.020.html