高效液相色譜法測(cè)定前列回春丸中虎杖苷的含量

張 紅 ，饒俊珍，程 璐(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430022)

前列回春丸是在前列回春膠囊的基礎(chǔ)上進(jìn)行劑型改革而進(jìn)一步研發(fā)的新制劑，為濃縮水丸，主要由虎杖、淫羊藿、炮山甲等19 味中藥組成，具有益腎回春、活血通淋、清熱解毒的功效。虎杖為方中主藥之一，虎杖苷為其專屬性指標(biāo)成分，本研究采用高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定前列回春丸中虎杖苷的含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

島津LC-10AT 型HPLC 儀、島津液相色譜儀紫外檢測(cè)器SPD-10A(日本島津公司)，浙大N2000 色譜工作站;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。前列回春丸供試品共9 批(規(guī)格:每8 丸相當(dāng)于原生藥3 g;批號(hào):131201、131202、131203、140101、140102、140103、140301、140302、140303);虎杖苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量測(cè)定用，批號(hào):111575-200301);乙腈為色譜純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

取經(jīng)五氧化二磷為干燥劑，減壓干燥24 h 的虎杖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加入稀乙醇制成每1 ml 含17.39 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液制備

取本品20 丸，研細(xì)，取細(xì)粉約1.5 g，精密稱定，置于50 ml具塞棕色錐形瓶中，加入稀乙醇25 ml，密塞，精密稱定，超聲處理(300 W，40 kHz)30 min，室溫［(25 ±2)℃］下放置，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液制備

按處方量稱取除虎杖外的所有組分，制備虎杖陰性對(duì)照樣品，同“2.2”項(xiàng)下方法操作，即得。

2.4 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS2Cl8柱(4.6 mm×250 mm，5μm);檢測(cè)波長(zhǎng):306 nm;流動(dòng)相:乙腈-水(V∶V=19∶81);柱溫:30 ℃;流速:1 ml/min;靈敏度:0.08 AUFS;理論板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)算不低于3 000;避光操作。

2.5 專屬性驗(yàn)證

分別取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液各20 μl，在“2.4”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，虎杖苷色譜峰峰形對(duì)稱，供試品色譜圖中虎杖苷峰能與其他成分很好地分離，陰性對(duì)照溶液在虎杖苷峰處基本無(wú)干擾，見圖1。

圖1 HPLC 圖Fig 1 HLPC chromatograms

2.6 精密度考察

精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次20 μl，峰面積RSD分別為0.78%、1.63%。

2.7 線性關(guān)系考察

精密稱取經(jīng)五氧化二磷為干燥劑，減壓干燥24 h 虎杖苷對(duì)照品7.88 mg，置于20 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密吸取10 ml 置于100 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇至刻度并搖勻;精密吸取1、3、5、7、9、11、13、15 ml 分別置于20 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇至刻度并搖勻，按色譜條件分別精密吸取20 μl 注入HPLC 儀，以注入的虎杖苷濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=10 367X-745.02，r=0.999 8。結(jié)果顯示，虎杖苷質(zhì)量濃度在1.97 ～29.55 μg/ml 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品(批號(hào):140101)溶液20 μl，分別在0、4、8、12、24 h 測(cè)定虎杖苷的峰面積。結(jié)果顯示，供試品溶液中被測(cè)成分在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為1.94%。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取前列回春丸(批號(hào):140101)6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μl 注入HPLC 儀，測(cè)定。結(jié)果顯示，虎杖苷含量平均值為128.1 μg/g，RSD為1.10%。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

稱取前列回春丸(批號(hào):140101)6 份，每份20 丸，研細(xì)，取細(xì)粉約0.75 g，精密稱定，精密加入同一濃度的虎杖苷對(duì)照品溶液1 ml(取虎杖苷9.92 mg 置于100 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻)，余按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算供試品中虎杖苷的回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.11 供試品含量測(cè)定

取前列回春丸9 批，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μl，注入HPLC 儀，測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 供試品虎杖苷含量測(cè)定結(jié)果(n=2)Tab 2 Results of determination of contents in the samples of polydatin(n=2)

3 討論

3.1 供試溶液制備方法的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道，供試溶液制備中所用的溶劑有甲醇［1-3］、稀乙醇［4-15］。采用這2 種溶劑進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果表明，用甲醇作為溶劑時(shí)，除虎杖苷峰外，其他峰數(shù)相對(duì)小和少，但從環(huán)?？紤]，在分離度能達(dá)到要求的前提下，選取稀乙醇為佳。文獻(xiàn)報(bào)道，供試溶液制備中所用的處理方法主要有超聲［1-11］與回流［12-15］。超聲處理方法較簡(jiǎn)便，且有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，采用超聲提取法虎杖苷的含量高于［3-6］或等于［7-9］回流提取。因此，本研究采用超聲處理方法，并比較15、20、30、40 min 的超聲時(shí)間與成分提取的關(guān)系，結(jié)果表明，超聲30 min 已能充分提取出樣品中的虎杖苷，故擬定超聲時(shí)間為30 min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相的選擇

參考《中華人民共和國(guó)藥典》等文獻(xiàn)，選定檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm、流動(dòng)相為乙腈-水［1-4，7-15］。調(diào)整流動(dòng)相比例為19∶81(V∶V)時(shí)，虎杖苷峰能與其他成分峰達(dá)到有效分離，分離度較好，色譜系統(tǒng)穩(wěn)定。該色譜系統(tǒng)的重復(fù)性和精密度均好，適用于前列回春丸中虎杖苷的定量分析。

綜上所述，HPLC 法測(cè)定前列回春丸中虎杖苷的含量，操作方便、專屬性強(qiáng)，可作為前列回春丸的質(zhì)量控制方法之一。

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