RIP1增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡

章余妹，吳 萍，張林杰，呂 磊，楊守梅

RIP1增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡

章余妹1，吳 萍1，張林杰1，呂 磊2，楊守梅2

目的 探討受體相互作用蛋白1（RIP1）增強(qiáng)順鉑（DDP）誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的敏感性。方法 單溶液細(xì)胞增殖分析（MTS）法檢測不同濃度DDP對食管癌細(xì)胞株KYSE510、KYSE410的增殖抑制作用；Annexin V／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測RIP1、半胱天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3）、PARP的蛋白表達(dá)。結(jié)果 DDP誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡具有劑量和時間相關(guān)性。凋亡率隨劑量增加和時間延長升高，RIP1蛋白的表達(dá)升高，DDP聯(lián)合RIP1特異性抑制劑處理食管癌細(xì)胞后，較敏感的KYSE510凋亡率明顯減少。結(jié)論 RIP1可能參與了DDP誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的作用。

食管癌；RIP1；順鉑；凋亡

食管癌是國內(nèi)外常見的消化道惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，全球每年新發(fā)食管癌48萬例，每年約有40萬人因此死亡，我國是食管癌高發(fā)國家［1］。輔助化療是治療食管癌的一種重要手段，但其預(yù)后的改善進(jìn)展卻很緩慢［2］。因此，研究增強(qiáng)食管癌對藥物治療敏感性的策略，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點至關(guān)重要。受體相互作用蛋白1（receptor-interacting protein 1，RIP1）包含一個N末端絲氨酸／蘇氨酸激酶活性和一個C末端死亡結(jié)構(gòu)域，是RIP家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的死亡和存活方面起重要作用［3－4］。然而，目前RIP1在食管癌細(xì)胞增殖、凋亡及藥物治療敏感性方面起何種作用尚不明確。該研究以食管癌細(xì)胞株KYSE510、KYSE410為研究對象，觀察RIP1對順鉑（cisplatin，DDP）誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞凋亡的影響，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人食管鱗癌細(xì)胞株KYSE510、KYSE410由安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；DDP（5 mg／ml，江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）；MTS（美國Promega公司）；小鼠抗人RIP1抗體（美國BD Pharmingen公司）；兔抗人半胱天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate specific protease 3，caspase-3）、PARP抗體（美國Santa Cruz公司）；小鼠抗人β-actin抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；小分子抑制劑（necrostatin-1，Nec-1）（德國Calbiochem公司）；Annexin V／PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博BestBio公司）；BCA蛋白定量試劑盒、Western一抗稀釋液（江蘇碧云天公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；天能全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞株KYSE510、KYSE410采用RPMI1640培養(yǎng)液，含10%滅活胎牛血清，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。常規(guī)傳代，生長至對數(shù)生長期。

1.2.2MTS法檢測 取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔中加100 μl含10 000個細(xì)胞的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。培養(yǎng)24 h后，棄去每孔培養(yǎng)液，換新鮮含10%胎牛血清培養(yǎng)液，實驗設(shè)不同濃度DDP處理組（藥物濃度為1、5、10、20、40 μg／ml）、不加DDP的空白對照組和無細(xì)胞僅培養(yǎng)液的凋零組。加藥后分別在24～72 h（藥物作用終點時間）終止培養(yǎng)，每孔加入MTS 10 μl，37℃避光孵育2 h，全自動定量繪圖酶標(biāo)儀測定每孔的490 nm波長光密度（optical density，OD）值，各組重復(fù)實驗3次。

1.2.3 Annexin V／PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)生長期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于24孔板，每孔中每1 ml含1×105個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌2次，按實驗設(shè)計加入藥物后，收集上清液中細(xì)胞并用不含EDTA的胰酶消化法收集貼壁細(xì)胞至10 ml離心管。用冷PBS洗滌細(xì)胞2次，1 400 r／min，2～8℃，離心5 min，棄培養(yǎng)液，用400 μl 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度約為1×106個／ml細(xì)胞。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min，加入10 μl PI染色液后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5 min。1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，每組實驗重復(fù)3次。FCS express 4軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達(dá) 5 μg／ml DDP作用于細(xì)胞不同時間點（0、6、12、24、36 h）后，分別收集上清液中細(xì)胞并加胰酶消化收集貼壁的細(xì)胞至離心管。用PBS洗滌2次，1 500 r／min，離心10 min，棄上清液，每管加入100 μl細(xì)胞總蛋白裂解液（90 μl裂解儲存液＋10 μl苯甲基磺酰氟化物），吸至1.5 ml EP管中，冰上孵育30 min，期間不時彈EP管。以4℃14 000 r／min，離心30 min后取上清液，此即為細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白定量后，加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸3 min使蛋白變性。取20 μg蛋白樣品在不同濃度的SDSPAGE凝膠中恒壓電泳約60 min，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜約70 min，防止氣泡產(chǎn)生，用含質(zhì)量為50 g／L脫脂奶粉的TBST封閉2 h，棄去封閉液。TBST洗滌3次，每次10 min，分別加入抗RIP1、caspase-3、PARP抗體，以β-actin為內(nèi)參，4℃孵育過夜，用TBST洗3次，每次10 min，再加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。ECL法顯色，照相并分析結(jié)果。每組實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以±s表示。多組均數(shù)間比較采用方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 DDP對食管癌KYSE510、KYSE410細(xì)胞的增殖抑制作用KYSE510、KYSE410細(xì)胞對DDP的半數(shù)抑制濃度分別為（5.021±0.069）μg／ml、（40.169±0.302）μg／ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；后者是前者的8倍，因此選5 μg／ml作為KYSE510和KYSE410的實驗濃度。5 μg／ml DDP作用于兩株細(xì)胞0、24、48、72 h，隨著時間的延長，KYSE510細(xì)胞存活率減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果顯示，DDP誘導(dǎo)食管癌KYSE510、KYSE410細(xì)胞凋亡具有濃度和時間相關(guān)性，且KYSE510對DDP誘導(dǎo)凋亡相對敏感。見圖1。

2.2 DDP誘導(dǎo)食管癌KYSE510、KYSE410細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示DDP能有效誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，隨著作用時間延長，細(xì)胞凋亡率逐漸上升。KYSE510細(xì)胞的早期凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝5 849.181，P＜0.01），KYSE410細(xì)胞的早期凋亡率差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝6 512.189，P＜0.01）。兩株細(xì)胞對DDP的敏感性不同，KYSE510比KYSE410細(xì)胞對DDP敏感，同一時間點的兩株細(xì)胞凋亡率之間進(jìn)行比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 RIP1在DDP處理食管癌細(xì)胞前后的蛋白表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果顯示KYSE510細(xì)胞RIP1表達(dá)水平較KYSE410細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；DDP處理前后KYSE510細(xì)胞RIP1表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3、4。

2.4 caspase-3、PARP在DDP處理食管癌細(xì)胞不同時間點的蛋白表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果顯示KYSE510細(xì)胞caspase-3、PARP活化并裂解。見圖5。

2.5 Nec-1聯(lián)合DDP處理細(xì)胞前后的凋亡流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：對DDP較敏感的KYSE510細(xì)胞加入Nec-1后早期凋亡率減少明顯，存活率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而相對不敏感的KYSE410細(xì)胞加入Nec-1后變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖6。

2.6 DDP聯(lián)合Nec-1處理細(xì)胞前后，RIP1、caspase-3、PARP的蛋白表達(dá)Western blot法檢測結(jié)果顯示DDP聯(lián)合Nec-1處理KYSE510、KYSE410細(xì)胞前后RIP1、caspase-3、PARP的蛋白表達(dá)。見圖7。

3 討論

DDP是常用的食管癌化療藥物之一，可通過產(chǎn)生烷化物作用于DNA，形成鏈內(nèi)和鏈間交聯(lián)，破壞腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)和功能，啟動DNA損傷性反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞凋亡途徑的激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡［5］。研究［5－6］表明，以DDP為基礎(chǔ)的化療開始療效較好，但隨著化療時間的延長、療程的增加、腫瘤細(xì)胞對DDP治療的敏感性降低或產(chǎn)生耐藥性，臨床療效降低。表明DDP對食管癌細(xì)胞之間存在敏感性差異。

RIP1在細(xì)胞的凋亡、程序性壞死與存活等過程中發(fā)揮了重要作用［7］。在促細(xì)胞死亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，RIP1的C末端死亡結(jié)構(gòu)域能與Fas、腫瘤壞死因子受體1、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1、受體2、腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域等蛋白相互作用，形成復(fù)合物，導(dǎo)致凋亡或程序性壞死［8］。Nec-1是RIP1的高度特異性抑制劑，通過變構(gòu)抑制RIP1的活性［9］，與RIP1的N端和C端結(jié)合產(chǎn)生變構(gòu)效應(yīng)，使RIP1保持在無活性的構(gòu)象［10］。抑制RIP1和相關(guān)受體相互作用，也阻止了凋亡或程序性壞死的進(jìn)行［11］。Nec-1的發(fā)現(xiàn)能有效地明確RIP1在不同細(xì)胞的死亡類型和在疾病中的作用［12］。本研究中，DDP在兩株食管鱗癌細(xì)胞中敏感性差異大，而RIP1在兩株細(xì)胞中的表達(dá)差異也較大；加入DDP后，較敏感細(xì)胞株KYSE510的RIP1上調(diào)明顯，而相對DDP耐受的KYSE410細(xì)胞株RIP1上調(diào)不明顯，表明RIP1可能增強(qiáng)DDP對食管鱗癌細(xì)胞的敏感性。caspase-3是凋亡的效應(yīng)分子，其活化后可導(dǎo)致凋亡；PARP激活后裂解，為caspases級聯(lián)反應(yīng)保存能量，使caspases依賴性的凋亡能夠順利進(jìn)行［13］。通過AnnexinV／PI雙染流式細(xì)胞儀檢測凋亡顯示，DDP誘導(dǎo)食管鱗癌凋亡隨著時間的延長凋亡率上升；加入Nec-1后，較敏感的KYSE510細(xì)胞凋亡率明顯減少，存活率增加，而相對耐受的KYSE410細(xì)胞差異不明顯。通過Western blot法檢測RIP1、caspase-3和PARP的蛋白表達(dá)，可以看出KYSE510細(xì)胞的RIP1在加入DDP后表達(dá)增強(qiáng)，加入DDP和Nec-1后表達(dá)減低；而KYSE410細(xì)胞則在加入DDP或DDP聯(lián)合Nec-1后無明顯變化。

綜上所述，RIP1參與DDP誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞的凋亡，并且Nec-1處理后對DDP敏感的食管癌細(xì)胞株凋亡率明顯減少，RIP1的蛋白表達(dá)減低，因此RIP1可能介導(dǎo)了DDP誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡的作用。本研究對進(jìn)一步探索抗腫瘤治療及抗癌藥的耐藥性提供了一定的基礎(chǔ)，但其深入的分子機(jī)制還有待研究。

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RIP1 enhances DDP sensitivity of human esophageal squamous carcinoma cells

Zhang Yumei，Wu Ping，Zhang Linjie，et al
（Dept of Immunology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the role of receptor-interacting protein 1（RIP1）on the sensitivity of human esophageal squamous carcinoma cells to cisplatin（DDP）-induced apoptosis and explore a new target for clinical treatment of esophageal squamous carcinoma.MethodsThe viability of human esophageal squamous carcinoma cell lines KYSE510 and KYSE410 exposed to different concentrations of DDP were detected by CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）assay.Annexin V／PI staining was used to observe cell apoptosis in KYSE510 and KYSE410 cells.Western blot was used to detect RIP1，caspase-3，PARP expression in KYSE510 and KYSE410 cells exposed to DDP.ResultsDDP induced apoptosis in esophageal squamous carcinoma cells with dose and time dependency.Apoptotic rate was increased with dose and time，RIP1 expression was upregulated in esophageal squamous carcinoma cell lines.It was significantly reduced after exposure to DDP association special inhibitor of RIP1 in KYSE510 cells which were more sensitive to DDP than KYSE410 cells.ConclusionRIP1 maybe participates in the apoptosis of human esophageal squamous carcinoma cells to DDP，suggesting the potential of RIP1 as a new candidate target for clinical treatment of esophageal squamous carcinoma.

esophageal squamous carcinoma；RIP1；cisplatin；apoptosis

R 735.1；R 329.25

1000－1492（2015）02－0172－05

2014－10－23接收

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究項目（編號：KJ2011A167）

1安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，合肥 2300322安徽省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，合肥 230001

章余妹，女，碩士研究生；張林杰，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zlj33＠vip.sina.com