中華枸杞葉片離體再生技術(shù)初探

侯典云+胥華偉+李雪林+馬占強(qiáng)+施江+張改娜

摘要：為探索中華枸杞（Lycium chinense Mill. var. chinense）葉片離體再生技術(shù)，通過設(shè)置不同消毒時(shí)間梯度，研究了0.1%升汞溶液對(duì)中華枸杞葉片的消毒效果;以MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA、2，4-D、IAA等激素，研究了不同激素濃度配比對(duì)中華枸杞葉片離體再生的影響。結(jié)果表明，用0.1%升汞溶液消毒葉片8 min，污染率最低，是中華枸杞葉片的最佳消毒時(shí)間?；九囵B(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L 2，4-D是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素濃度配比;基本培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA是誘導(dǎo)愈傷組織分化的最佳激素濃度配比;基本培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L IAA +0.6 mg/L NAA是誘導(dǎo)叢生芽生根的適宜激素濃度配比。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可有效實(shí)現(xiàn)中華枸杞葉片離體再生和快速繁殖，為其工廠化育苗和優(yōu)良品種的選育奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中華枸杞（Lycium chinense Mill. var. chinense）;葉片;離體再生;組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：R282.71;Q813.1+2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）12-2928-04

Preliminary Study on Vitro Regeneration from Leaves of Lycium chinense

Mill. Var. Chinense

HOU Dian-yun，XU Hua-wei，LI Xue-lin，MA Zhan-qiang，SHI Jiang，ZHANG Gai-na

（College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Hennan，China）

Abstract： To explore the vitro regeneration from leaves of Lycium chinense Mill. var. chinense， a gradient of different disinfection time have been set up to study the effect of the 0.1% mercuric chloride solution to disinfect the leaves of L. chinense Mill. var. chinense. Depending on the MS base medium， the plant hormones 6-BA，2，4-D and IAA ?were added in the MS. Through the orthogonal experiment， the effects of different plant hormones concentration ratio on the vitro regeneration from leaves of L. chinense Mill. var. chinense have been studied. The pollution rate was the lowest when the leaves were dealt with 0.1% mercuric chloride solution in 8 min（the best sterilization time）. MS medium with 1.0 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L 2，4-D was the best hormone concentration ratio to induce callus. MS medium with 1.0 mg/L 6-BA and 0.1 mg/L NAA was the best hormone concentration ratio to induce callus differentiation. Using tissue culture technology can not only effectively achieve the vitro regeneration and rapid propagation from leaves of L. chinense Mill. var. chinense， but also lay foundation for industrialized seedling production and the seed selection.

Key words： Lycium chinense Mill. var. chinense; leaves; vitro regeneration; tissue culture

枸杞（Lycium chinense）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多分枝灌木，是名貴的藥食同源植物，全世界約有80個(gè)品種，多數(shù)分布在美洲，其中南美洲種類最多，歐亞大陸約有10種。我國有7個(gè)品種和3個(gè)變種，多數(shù)分布在西北地區(qū)和華北地區(qū)[1，2]。枸杞營養(yǎng)成分豐富，富含糖類、有機(jī)酸、氨基酸等物質(zhì)，具有抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤和降血糖、降血脂等重要功能，在傳統(tǒng)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3，4]。中華枸杞是枸杞原變種（Lycium chinense Mill. var. chinense）的俗名，由于其果大、子少、皮薄、肉厚等特點(diǎn)，許多地方均引種栽培中華枸杞[5]，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益。

枸杞為典型的異花授粉植物，其基因型高度雜合，長期的天然雜交和種子繁殖，導(dǎo)致現(xiàn)有品種混亂，不利于保持品種的優(yōu)良特性，而枸杞常用的硬枝和嫩枝扦插技術(shù)經(jīng)常出現(xiàn)植株生長勢弱和早衰的現(xiàn)象，而且生根困難。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在解決枸杞的優(yōu)良品種選育和工廠化育苗等方面的研究逐步深入[6-13]。枸杞不同品種之間由于基因型的不同和生理類型的差異導(dǎo)致組織培養(yǎng)中對(duì)激素種類、濃度、生長環(huán)境和營養(yǎng)狀況的要求也不同[8]。本研究以中華枸杞為研究對(duì)象，探索中華枸杞葉片離體再生技術(shù)，為其優(yōu)良、抗逆新品種的選育奠定基礎(chǔ)，也為其遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建提供參考。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中華枸杞是由河南省靈寶市天豐苗木有限責(zé)任公司提供的中華枸杞的幼嫩枝條，在實(shí)驗(yàn)室沙基中扦插培養(yǎng)，保持水分和適當(dāng)光照，選擇扦插苗的幼嫩葉片備用。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ?外植體的消毒 ?取中華枸杞幼嫩葉片用去離子水沖洗干凈，再用70%乙醇浸泡10 s，再用無菌的去離子水沖洗2次，放入0.1%升汞溶液中消毒，設(shè)置4、6、8、10和12 min 5個(gè)消毒時(shí)間梯度，最后用無菌去離子水沖洗3～5次，備用。

1.2.2 ?愈傷組織的誘導(dǎo) ?以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖3%，瓊脂1%，pH 5.5～6.0，6-BA（6-芐基氨基嘌呤） 和2，4-D（2，4二氯苯氧乙酸），采用不同濃度組合進(jìn)行試驗(yàn)（表1）。將葉片切成1.0 cm×1.0 cm小塊，每瓶接種5塊，每個(gè)處理接種10瓶，設(shè)3個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，2周后統(tǒng)計(jì)生成的愈傷組織數(shù)和出愈率。

1.2.3 ?愈傷組織的分化 ?以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖3%，瓊脂1%，pH 5.5～6.0，6-BA和NAA（萘乙酸），采用不同激素配比進(jìn)行試驗(yàn)（表2），每瓶接種6塊愈傷組織，每個(gè)處理接種10瓶，設(shè)3個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，光照時(shí)間10 h/d，光照度1 500 lx，4周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化情況。

1.2.4 ?不定芽生根的誘導(dǎo) ?以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖3%，瓊脂1%，pH 5.5～6.0，NAA和IAA（吲哚乙酸），采用不同激素配比進(jìn)行試驗(yàn)（表3），每個(gè)濃度處理接種10瓶，每個(gè)瓶內(nèi)接芽6株。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)3，4周后統(tǒng)計(jì)生根率，記錄生長狀況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同消毒時(shí)間對(duì)中華枸杞葉片外植體的影響

獲得無菌外植體是組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素，采用0.1%升汞溶液對(duì)中華枸杞葉片進(jìn)行消毒處理，設(shè)置5個(gè)消毒時(shí)間梯度。結(jié)果（表4）表明，0.1%升汞溶液消毒8 min效果最好，污染率和死亡率都最低，分別為12%和14%;消毒時(shí)間為4 min和6 min時(shí)，污染率較高，分別達(dá)到54%和48%;消毒時(shí)間超過8 min，雖然污染率較低，但死亡率卻較高，消毒時(shí)間為12 min時(shí)，葉片的死亡率高達(dá)56%。

2.2 ?不同激素濃度配比對(duì)中華枸杞葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體接種在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上生長結(jié)果見表5。由表5可知，處理9的出愈率最低，僅為42%，處理5接種的外植體誘導(dǎo)出愈傷組織較多，出愈率高達(dá)92%，明顯高于其他處理的愈傷組織誘導(dǎo)率，為較適宜的激素組合。

2.3 ?不同激素濃度配比對(duì)愈傷組織分化的影響

不同激素濃度配比對(duì)中華枸杞愈傷組織分化的影響不同（表6）。由表6可知，處理5的愈傷組織分化率最高（92%），而且分化較快;處理1的分化率最低，僅為35%，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，大量愈傷組織褐化死亡;處理9的分化率也較低，為50%，因此激素濃度過高或者過低，都會(huì)不利于中華枸杞葉片愈傷組織的分化。處理5的激素濃度配比是誘導(dǎo)愈傷組織分化的最佳激素濃度配比。

2.4 ?不同激素濃度配比對(duì)不定芽生根的影響

中華枸杞為多年生木本灌木，其組培苗的生根相對(duì)困難。本研究中把叢生芽轉(zhuǎn)接到含有IAA和NAA的生根培養(yǎng)基中，設(shè)置不同的激素濃度配比。結(jié)果表明，不同的激素濃度配比誘導(dǎo)叢生芽生根的能力不同，其中處理5（0.2 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA）的激素濃度配比生根率最高，為50%（表7）。

3 ?小結(jié)與討論

枸杞屬植物組織培養(yǎng)技術(shù)雖然已有報(bào)道[10-13]，本試驗(yàn)首次研究了中華枸杞的葉片離體再生技術(shù)，對(duì)于中華枸杞的快速繁殖和工廠化生產(chǎn)意義深遠(yuǎn)。

1）外植體污染是組織培養(yǎng)技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵問題，能否控制污染直接關(guān)系到試驗(yàn)的成敗。本研究通過設(shè)置不同消毒時(shí)間，利用0.1%升汞溶液對(duì)中華枸杞葉片進(jìn)行消毒，當(dāng)處理1和處理2消毒時(shí)間較短時(shí)，由于升汞溶液的重金屬離子沒有足夠的時(shí)間與細(xì)菌蛋白結(jié)合并使細(xì)菌蛋白變性，因此結(jié)果顯示葉片的污染率較高，而隨著消毒時(shí)間的延長，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到10 min和12 min時(shí)，由于消毒時(shí)間過長，重金屬離子在使細(xì)菌蛋白變性同時(shí)也侵入到葉片細(xì)胞內(nèi)部并累積，最終對(duì)葉片細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，盡管葉片的污染率不高，但由于重金屬的毒害而造成的葉片死亡率卻顯著上升。本研究中選用的為中華枸杞扦插苗的幼嫩葉片，其較佳消毒時(shí)間為8 min，不同生長發(fā)育階段的葉片對(duì)升汞溶液的耐受程度也不盡相同，都需要設(shè)置時(shí)間梯度進(jìn)行研究。

2）激素是植物組織培養(yǎng)器官分化的關(guān)鍵因素[14]，形成器官的類型是由培養(yǎng)基中不同激素的相對(duì)濃度控制，而不是由這些物質(zhì)的絕對(duì)濃度決定的[15]。細(xì)胞分裂素對(duì)植物的生長和發(fā)育有多方面的調(diào)節(jié)作用，如果細(xì)胞分裂素含量過高，則會(huì)抑制愈傷組織的形成[16]。本試驗(yàn)研究了不同激素濃度配比對(duì)中華枸杞葉片愈傷組織的形成、分化及叢生芽生根的影響。結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2，4-D是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素濃度配比，而基本培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是誘導(dǎo)愈傷組織分化的最佳激素濃度配比。本研究中基本培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA可以有效誘導(dǎo)叢生芽生根，但生根率僅為50%，而且獲得的不定根長勢也不好，可能是培養(yǎng)過程中光照不足，或生長素的濃度偏低，后續(xù)試驗(yàn)需要進(jìn)一步完善不定芽的生根技術(shù)，并進(jìn)行組培苗的馴化、移栽研究。

建立穩(wěn)定的植物組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化操作的基礎(chǔ)，枸杞為雙子葉植物，其高雜合性、多倍性和無性生殖等特點(diǎn)使其成為生物反應(yīng)器的首選，而且以枸杞為材料易于遺傳操作，可以長期栽培生長，遺傳性狀穩(wěn)定[17]。因此，針對(duì)不同基因型的枸杞構(gòu)建其成熟的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為枸杞品種改良開辟一條新的途徑，也為枸杞轉(zhuǎn)基因和生物反應(yīng)器的研究奠定了基礎(chǔ)。endprint

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