小麥DREB基因的克隆及植物表達載體構(gòu)建

于月華+張躍強+倪志勇+海熱古力·阿不力孜

摘要：脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白在高等植物應(yīng)答干旱、高鹽和低溫脅迫中發(fā)揮重要的作用。根據(jù)GenBank中小麥（Triticum aestivum L.）DREB基因的cDNA序列設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)從小麥中克隆了DREB基因837 bp的編碼區(qū)。為進一步研究小麥DREB基因的功能，以pMD18-T-DREB質(zhì)粒為模板，PCR擴增DREB基因片段，構(gòu)建了該基因的植物表達載體。經(jīng)菌液PCR和測序鑒定后，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入研究小麥DREB基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：植物表達載體;小麥（Triticum aestivum L.）;DREB基因

中圖分類號：Q78 ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2925-03

Cloning of DREB Gene of Triticum aestivum and Construction of Its Plant Expression Vectors

YU Yue-hua1， ZHANG Yue-qiang2， NI Zhi-yong1， HAIREGULI·ABULIZI2

（1. College of Agronomy/Key Laboratory of Agricultural Biological Technology， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China;

2. Institute of Nuclear and Biological Technologies， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China）

Abstract： Dehydration-responsive element binding protein played critical roles in the response to dehydration， salinity， and cold stresses in higher plants. Primers were designed according to the cDNA sequence of wheat DREB gene in Genbank， a length of 837 bp from cDNA of DREB gene was cloned by RT-PCR. To investigate the function of DREB gene in wheat，the plant expression vector of DREB gene was constructed. The full-length open reading frame of DREB gene was amplified by PCR using pMD18-T-DREB as template. PCR and sequencing results showed that plant expression vector of DREB gene was constructed successfully. This constructed vector was then transformed into Agrobacterium LBA4404. This constructed vector provided an effective tool for the further study of DREB gene function.

Key words： plant expression vector; wheat（Triticum aestivum L.）; DREB gene

高等植物中脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（Dehydration-responsive element binding protein，DREB）在應(yīng)答脫水、高鹽和冷脅迫中具有重要的作用[1，2]。DREB轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合目標基因啟動子區(qū)域中的脫水應(yīng)答元件DREs/CRTs，提高轉(zhuǎn)基因植物對干旱、高鹽和冷脅迫的耐受性[3，4]。通過在模式植物中過表達DREB基因，已經(jīng)揭示了許多植物的DREB基因在逆境脅迫應(yīng)答中的作用[5]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過表達大麥（Hordeum vulgare L.）HvDREB1基因，在正常生長條件下激活下游基因RD29A的表達，提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的忍耐能力[6]。過表達水稻（Oryza sativa L.）OsDREB1A基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，在正常生長條件下激活目標基因的表達，提高轉(zhuǎn)基因植物對干旱和低溫的耐受性[7]。過表達大豆（Glycine max Merr.）GmDREB2基因提高轉(zhuǎn)基因植物對干旱和高鹽的忍耐能力[8]。因此，通過控制DREB轉(zhuǎn)錄因子的表達有可能提高多種作物對非生物脅迫的忍耐能力[9]。目前，已經(jīng)從許多植物中克隆了DREB基因，包括水稻[7]、玉米（Zea mays L.）[10]、大豆[8]和小麥（Triticum aestivum L.）[11，12]。

小麥是中國乃至全世界最重要的糧食作物之一[13]，中國小麥主產(chǎn)區(qū)主要分布在干旱、半干旱地區(qū)，提高小麥對干旱脅迫的耐受性來增加小麥產(chǎn)量，將極大地提高中國應(yīng)對糧食安全問題的能力。本研究根據(jù)GenBank中的小麥DREB基因序列，設(shè)計帶有酶切位點的引物，從新春6號小麥品種中克隆了DREB基因，構(gòu)建了植物表達載體，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，為進一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化小麥奠定了基礎(chǔ)。endprint

1 ?材料和方法

1.1 ?材料

供試小麥品種為新春6號，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所小麥育種課題組提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?RNA的提取及cDNA的合成 ?生長10 d 新春6號小麥幼苗經(jīng)20%聚乙二醇（PEG）處理6 h后取樣，參照Trizol試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]使用說明，提取經(jīng)PEG處理的小麥葉片總RNA。利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶[寶生物工程（大連）有限公司]反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。取1 μg總RNA作為模板進行RT-PCR，20 μL體系中包含總RNA 1 μg，DEPC水6.5 μL，Olig（dT）15 1 μL，75 ℃保溫5 min后，冰上冰浴5 min，然后依次加入0.5 μL RNase inhibitor，4 μL 5×AMV Buffer，2 μL dNTPs（10 mmol/L）和1 μL AMV（100 U/μL），25 ℃保溫10 min，42 ℃溫育90 min，95 ℃變性5 min，冰上冰浴5 min。

1.2.2 ?小麥DREB基因編碼區(qū)的克隆 ?根據(jù)GenBank中的小麥DREB基因序列（登錄號：AY781361）和植物表達載體pCAMBIA3301的酶切位點設(shè)計合成一對帶有限制性內(nèi)切酶的引物DREB-F：5′-TAACCATGGATGGAGACCGGGGGTAGCAA-3′和DREB-R：5′-TATAGATCTCTAATATGAGAAAAGACTAAA-3′（下劃線分別為Nco I和Bgl II酶切位點），以20% PEG處理6 h的葉片cDNA第一鏈為模板，擴增基因編碼區(qū)。50 μL體系中含cDNA（20 ng/μL） 1 μL，2×GC-PCR Buffer II 25 μL，dNTPs（10 mmol/L）2 μL，引物（25 μmol/L） 1 μL和LA Taq酶（5 U/μL）0.5 μL[寶生物工程（大連）有限公司]，補ddH2O至50 μL。PCR 程序為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，66 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用紫外凝膠成像儀（Bio-Rad公司）觀察結(jié)果。采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]回收目的片段，將回收產(chǎn)物與pMD18-T[寶生物工程（大連）有限公司]載體連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞[天根生化科技（北京）有限公司]，與X-gal和IPTG涂于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后挑取白色克隆，經(jīng)含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)12 h。菌液PCR檢測是否有插入片段，并陽性克隆送上海美季生物技術(shù)公司測序，采用DNAMAN軟件分析比對測序結(jié)果。

1.2.3 ?小麥DREB基因表達載體的構(gòu)建及鑒定 ?以含有小麥DREB基因編碼區(qū)的pMD18-T-DREB質(zhì)粒為模板，使用DREB-F和DREB-R引物，用高保真酶[寶生物工程（大連）有限公司]擴增兩端帶有Nco I和Bgl II酶切位點的小麥DREB基因編碼區(qū)序列。PCR擴增體系和擴增程序同上。獲得的小麥DREB基因PCR產(chǎn)物，凝膠回收后，用Nco I和Bgl II（Fermentas公司）酶切PCR回收產(chǎn)物和表達載體pCAMBIA3301質(zhì)粒。50 μL體系中包含：質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物（5 μg）10 μL，Nco I 5 μL，Bgl II 5 μL，10×Fast Digest Buffer 5 μL和ddH2O 25 μL。回收雙酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶（Fermentas公司）將DREB片段連接到pCAMBIA3301載體中，22 ℃孵育10 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞[天根生化科技（北京）有限公司]。菌液PCR鑒定構(gòu)建的DREB基因植物表達載體，并將陽性克隆送上海美季生物技術(shù)公司測序。

1.2.4 ?小麥DREB基因表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 ?LBA

4404提取小麥DREB基因表達載體pCAMBIA3301-DREB的質(zhì)粒，以凍融法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞。具體方法參照倪志勇等[14]的方法。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?小麥DREB基因編碼區(qū)的克隆及序列比對

根據(jù)GenBank中的小麥DREB基因序列（登錄號：AY781361），設(shè)計一對帶有酶切位點的引物，用RT-PCR方法從經(jīng)20% PEG處理6 h的新春6號小麥葉片中擴增到DREB基因的編碼區(qū)，擴增片段大小為837 bp（圖1）。將擴增片段連接到克隆載體pMD18-T，測序后與GenBank中的小麥DREB基因序列進行比對，結(jié)果表明兩個序列完全一致，說明獲得的小麥DREB基因編碼區(qū)是正確的，沒有發(fā)生堿基變化，可以用來構(gòu)建植物表達載體。

2.2 ?小麥DREB基因表達載體的構(gòu)建

用前向帶有Nco I和反向帶有Bgl II酶切位點的小麥DREB基因引物，以pMD18-T-DREB質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴增獲得兩端帶有Nco I和Bgl II酶切位點的小麥DREB基因編碼區(qū)片段，擴增產(chǎn)物大小約837 bp，與預(yù)期大小相符，且無非特異擴增帶。將目的片段回收純化后，用Nco I和Bgl II酶切，連接到用相同酶切回收后的表達載體pCAMBIA3301上，熱激轉(zhuǎn)化E. coli DH5α，獲得pCAMBIA3301-DREB表達載體（圖2）。對重組質(zhì)粒用DREB-F和DREB-R引物進行PCR鑒定，能夠擴增出一條長約837 bp的目的基因條帶（圖3）。將陽性克隆測序，序列比對結(jié)果正確，說明小麥DREB基因表達載體構(gòu)建成功。endprint

2.3 ?小麥DREB基因表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404

將構(gòu)建好的植物表達載體pCAMBIA3301-DREB通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素進行篩選，待轉(zhuǎn)化子菌落長出后，挑取單菌落搖菌，采用DREB-F和DREB-R引物進行農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖4可以看出，能夠從轉(zhuǎn)化表達載體的農(nóng)桿菌菌液中獲得大小為837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表達載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，可直接用于后續(xù)的小麥轉(zhuǎn)化工作。

3 ?小結(jié)與討論

新春6號小麥品種對高溫和干旱的抗性較強，是新疆春小麥超高產(chǎn)品種[15]。為了獲得抗旱性基因，本研究根據(jù)GenBank中小麥DREB基因的序列，從新疆小麥品種新春6號中克隆了該基因的編碼區(qū)序列，序列比對發(fā)現(xiàn)獲得的DREB編碼區(qū)序列與GenBank中的小麥DREB基因序列完全一致，沒有發(fā)生堿基的變化。將該編碼區(qū)序列克隆到植物表達載體pCAMBIA3301中并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404中，為使用農(nóng)桿菌浸染的方法轉(zhuǎn)化小麥品種打下基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]LIU Q，KASUGA M，SAKUMA Y，et al.Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expression， respectively，in Arabidopsis[J].Plant Cell，1998，10（8）：1391-1406.

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[14] 倪志勇，馬文靜，呂 ?萌，等. 棉花肉桂醇脫氫酶基因GhCAD6的克隆及正義、反義與RNAi干擾載體的構(gòu)建[J].華北農(nóng)學(xué)報，2009，24（6）：20-26.

[15] 吳振錄. 新疆春小麥超高產(chǎn)育種及超高產(chǎn)品種新春6號的育成[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（2）：57-59.endprint

2.3 ?小麥DREB基因表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404

將構(gòu)建好的植物表達載體pCAMBIA3301-DREB通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素進行篩選，待轉(zhuǎn)化子菌落長出后，挑取單菌落搖菌，采用DREB-F和DREB-R引物進行農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖4可以看出，能夠從轉(zhuǎn)化表達載體的農(nóng)桿菌菌液中獲得大小為837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表達載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，可直接用于后續(xù)的小麥轉(zhuǎn)化工作。

3 ?小結(jié)與討論

新春6號小麥品種對高溫和干旱的抗性較強，是新疆春小麥超高產(chǎn)品種[15]。為了獲得抗旱性基因，本研究根據(jù)GenBank中小麥DREB基因的序列，從新疆小麥品種新春6號中克隆了該基因的編碼區(qū)序列，序列比對發(fā)現(xiàn)獲得的DREB編碼區(qū)序列與GenBank中的小麥DREB基因序列完全一致，沒有發(fā)生堿基的變化。將該編碼區(qū)序列克隆到植物表達載體pCAMBIA3301中并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404中，為使用農(nóng)桿菌浸染的方法轉(zhuǎn)化小麥品種打下基礎(chǔ)。

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[15] 吳振錄. 新疆春小麥超高產(chǎn)育種及超高產(chǎn)品種新春6號的育成[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994（2）：57-59.endprint

2.3 ?小麥DREB基因表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404

將構(gòu)建好的植物表達載體pCAMBIA3301-DREB通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，用利福平和卡那霉素進行篩選，待轉(zhuǎn)化子菌落長出后，挑取單菌落搖菌，采用DREB-F和DREB-R引物進行農(nóng)桿菌菌液PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖4可以看出，能夠從轉(zhuǎn)化表達載體的農(nóng)桿菌菌液中獲得大小為837 bp的目的片段，表明含有DREB基因的植物表達載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中，可直接用于后續(xù)的小麥轉(zhuǎn)化工作。

3 ?小結(jié)與討論

新春6號小麥品種對高溫和干旱的抗性較強，是新疆春小麥超高產(chǎn)品種[15]。為了獲得抗旱性基因，本研究根據(jù)GenBank中小麥DREB基因的序列，從新疆小麥品種新春6號中克隆了該基因的編碼區(qū)序列，序列比對發(fā)現(xiàn)獲得的DREB編碼區(qū)序列與GenBank中的小麥DREB基因序列完全一致，沒有發(fā)生堿基的變化。將該編碼區(qū)序列克隆到植物表達載體pCAMBIA3301中并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404中，為使用農(nóng)桿菌浸染的方法轉(zhuǎn)化小麥品種打下基礎(chǔ)。

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