鎖陽中熊果酸的超聲提取及高效液相色譜法測定

危晴+楊國偉+蘇東海+陳亮

摘要：采用超聲波輔助萃取法提取，高效液相色譜法測定了鎖陽（Cynomorium songaricum）中的熊果酸含量。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率為研究對象，進(jìn)行了4因素3水平正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為y=622.7x-85.517，r=0.999 8，加樣回收率為98.08%。鎖陽中熊果酸最佳提取工藝為：超聲功率150 W，料液比1∶25，85%（V/V，下同）乙醇超聲提取30 min，在此條件下，鎖陽中熊果酸含量為1.53%。該工藝能有效提取鎖陽中熊果酸，為評價(jià)中藥材中的熊果酸水平提供參考。

關(guān)鍵詞：鎖陽（Cynomorium songaricum）;熊果酸;超聲提取;高效液相色譜

中圖分類號：TS201.2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號：0439-8114（2014）12-2894-04

Ultrasonic Extraction and HPLC Determination of Ursolic Acid in Cynomorium songaricun

WEI Qing，YANG Guo-wei，SU Dong-hai，CHEN Liang

（Beijing Polytechnic，Beijing 100029，China）

Abstract：Ursolic acid in Cynomorium songaricum was ultrasonically extracted and detected by HPLC. According to single-factor experiments，three levels of four factors including ethanol concentration，material-liquid ratio，ultrasonic time， and ultrasonic power were selected for the orthogonal design.The results showed that the calibration curve of ursolic acid was linear （r=0.999 8） in the range of 4.0～16.0 μg/μL.The equation was y=622.7x-85.517，r=0.999 8，and recovery was 98.08%.The optimum extraction was carried out in 85%（V/V） ethanol for 30 min with the ultrasonic power of 150 W，and the material-liquid ratio 1∶25.Under the optimal conditions，the content of ursolic acid was 1.53%.The method can extract ursolic acid efficiently，and provide a reference for evaluation ursolic acid in medicinal materials.

Key words：Cynomorium songaricum;ursolic acid;ultrasonic extraction; HPLC

鎖陽（Cynomorium songaricum）是一種稀有名貴中草藥，俗稱“不老藥”，是鎖陽科鎖陽屬的單科單屬單種植物[1，2]，含有多種藥用成分，例如：有機(jī)酸、黃酮類、氨基酸等[3-6]，具有抗腫瘤、降低血糖等作用[7]。鎖陽中的熊果酸（ursolic acid）又名烏索酸、烏蘇酸，是存在于天然植物中的一種三萜類化合物[8]，具有保肝、抗腫瘤、降血脂等作用[9]。熊果酸主要通過酶法輔助法[10]、有機(jī)溶劑萃取法[11]、大孔樹脂吸附法[12]、超臨界萃取法[13]、超聲輔助[14]等方法提取;采用分光光度法[15，16]、高效液相色譜法[17]、近紅外光譜測定法[18]、薄層掃描[19]等方法測定。

本試驗(yàn)以鎖陽為原料，采用超聲輔助醇法提取鎖陽中熊果酸，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率為因素，通過單因素和正交試驗(yàn)確定最佳提取工藝，旨在為鎖陽中熊果酸的進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

鎖陽產(chǎn)自甘肅省張掖平西湖地區(qū)。

1.2 ?儀器與試劑

1100型高效液相色譜儀（Agilent，美國）;AR2140型電子分析天平（上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）;4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（海道爾夫，德國）;SHB-II循環(huán)式真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;恒溫水浴鍋HH-S（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）;粉碎機(jī)（瑞安市百信藥機(jī)器械廠）;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;標(biāo)準(zhǔn)篩（新鄉(xiāng)市三圓堂機(jī)械有限公司）;KQ250DE數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）;甲醇為色譜純，無水乙醇為分析純，去離子水。

1.3 ?方法

1.3.1 ?色譜條件 ?Atlantis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相為水-甲醇（10∶90，V/V），流速為0.8 mL/min，檢測波長205 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 ?熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?稱取105 ℃干燥至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制0.80 μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液5～20 μL，甲醇定容至10 mL，進(jìn)樣并測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程。endprint

1.3.3 ?熊果酸的提取與分析 ?稱取5 g鎖陽粉末樣品（粉碎機(jī)粉碎，過40目篩），按照1∶40（m/V，下同）加入氯仿回流3 h脫脂，回收溶劑，殘?jiān)鼡]干。用85%乙醇（V/V，下同）按20∶1液固比浸泡殘?jiān)?4 h后，超聲波提取45 min，離心得提取液，濾渣重復(fù)提取1次，合并提取液減壓濃縮，取出殘留液，甲醇定容至25 mL。取樣品過0.45 μm微孔濾膜后，在上述色譜條件下測定熊果酸的含量

1.3.4 ?鎖陽中熊果酸提取的單因素試驗(yàn) ?①乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，按照料液比1∶20準(zhǔn)確加入70%～95%乙醇溶液，超聲功率150 W，超聲45 min后，參照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，按不同料液比（1∶5～1∶30）加入85%乙醇溶液，超聲功率150 W，超聲時(shí)間45 min，后續(xù)步驟同①;③超聲時(shí)間。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，料液比1∶20，乙醇濃度85%，超聲功率150 W，選取超聲波輔助提取的時(shí)間為10～60 min，離心取上清液，后續(xù)步驟同①;④超聲功率。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比1∶20，超聲時(shí)間40 min，超聲波功率選擇50～300 W，后續(xù)步驟同①。

1.3.5 ?正交試驗(yàn) ?在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮多因素相互作用對鎖陽熊果酸提取的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?色譜分析結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液中熊果酸色譜圖分別見圖1和圖2。在該條件下，熊果酸可有效分離。

2.2 ?單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3～圖6。

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，熊果酸含量最大;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，含量呈下降趨勢。主要原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)導(dǎo)致過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭，導(dǎo)致提取的熊果酸含量下降。

由圖4可知，隨著料液比增大，熊果酸含量逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，熊果酸含量最大;隨著料液比增大，熊果酸含量呈下降趨勢。主要原因是隨著料液比增大，鎖陽中其他成分溶解的幾率增大，同時(shí)延長了后續(xù)的濃縮過程，造成熊果酸的損失。

由圖5可知，當(dāng)超聲40 min時(shí)，熊果酸含量最大。隨著超聲時(shí)間的延長，過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭，影響了熊果酸的提取率，造成含量下降。

由圖6可知，超聲功率為150 W時(shí)，熊果酸含量達(dá)到最大;但過強(qiáng)的超聲波機(jī)械剪切力，破壞了熊果酸的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熊果酸含量下降。

2.3 ?正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率的4因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2極差分析可知，影響熊果酸提取效率的主次因素分別為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A2B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W，在此組合下，獲得樣品中的熊果酸可達(dá)1.53%。

2.4 方法評價(jià)

吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得峰面積RSD為1.39%，表明儀器精密度良好。

吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，進(jìn)樣，分別于0～6 h，每間隔0.5 h重復(fù)上述操作，求得峰面積RSD為1.9%，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

吸取已知濃度的供試品溶液500 μL，加入0.80 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL，混勻，進(jìn)樣10 μL，平行測定3次，求得熊果酸平均回收率為98.08%。

稱取已知濃度的同一樣品6份，依次分別制得樣品溶液，精密吸取樣品溶液10 μL，進(jìn)樣，求得峰面積RSD為1.9%。

3 ?結(jié)論

鎖陽中熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8），其回歸方程為y=622.7x-85.517，r=0.999 8。精密度RSD為1.39%，加樣回收率平均為98.08%，RSD為1.9%。熊果酸提取的最佳工藝條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W，鎖陽中熊果酸的含量約為1.53%。該方法提取鎖陽中的熊果酸含量較高，可為開發(fā)利用相關(guān)藥材提供參考。

參考文獻(xiàn)：

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[18] 宋麗麗，范丙義，徐曉杰，等.近紅外光譜法用于六味地黃丸模擬樣品中熊果酸的含量測定[J].中國中藥雜志，2006，31（19）：1590-1593.

[19] 邱 ?震，周家才.薄層掃描法測定左歸丸中熊果酸含量[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（8）：698-699.endprint

1.3.3 ?熊果酸的提取與分析 ?稱取5 g鎖陽粉末樣品（粉碎機(jī)粉碎，過40目篩），按照1∶40（m/V，下同）加入氯仿回流3 h脫脂，回收溶劑，殘?jiān)鼡]干。用85%乙醇（V/V，下同）按20∶1液固比浸泡殘?jiān)?4 h后，超聲波提取45 min，離心得提取液，濾渣重復(fù)提取1次，合并提取液減壓濃縮，取出殘留液，甲醇定容至25 mL。取樣品過0.45 μm微孔濾膜后，在上述色譜條件下測定熊果酸的含量

1.3.4 ?鎖陽中熊果酸提取的單因素試驗(yàn) ?①乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，按照料液比1∶20準(zhǔn)確加入70%～95%乙醇溶液，超聲功率150 W，超聲45 min后，參照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，按不同料液比（1∶5～1∶30）加入85%乙醇溶液，超聲功率150 W，超聲時(shí)間45 min，后續(xù)步驟同①;③超聲時(shí)間。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，料液比1∶20，乙醇濃度85%，超聲功率150 W，選取超聲波輔助提取的時(shí)間為10～60 min，離心取上清液，后續(xù)步驟同①;④超聲功率。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比1∶20，超聲時(shí)間40 min，超聲波功率選擇50～300 W，后續(xù)步驟同①。

1.3.5 ?正交試驗(yàn) ?在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮多因素相互作用對鎖陽熊果酸提取的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?色譜分析結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液中熊果酸色譜圖分別見圖1和圖2。在該條件下，熊果酸可有效分離。

2.2 ?單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3～圖6。

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，熊果酸含量最大;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，含量呈下降趨勢。主要原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)導(dǎo)致過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭，導(dǎo)致提取的熊果酸含量下降。

由圖4可知，隨著料液比增大，熊果酸含量逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，熊果酸含量最大;隨著料液比增大，熊果酸含量呈下降趨勢。主要原因是隨著料液比增大，鎖陽中其他成分溶解的幾率增大，同時(shí)延長了后續(xù)的濃縮過程，造成熊果酸的損失。

由圖5可知，當(dāng)超聲40 min時(shí)，熊果酸含量最大。隨著超聲時(shí)間的延長，過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭，影響了熊果酸的提取率，造成含量下降。

由圖6可知，超聲功率為150 W時(shí)，熊果酸含量達(dá)到最大;但過強(qiáng)的超聲波機(jī)械剪切力，破壞了熊果酸的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熊果酸含量下降。

2.3 ?正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率的4因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2極差分析可知，影響熊果酸提取效率的主次因素分別為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A2B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W，在此組合下，獲得樣品中的熊果酸可達(dá)1.53%。

2.4 方法評價(jià)

吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得峰面積RSD為1.39%，表明儀器精密度良好。

吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，進(jìn)樣，分別于0～6 h，每間隔0.5 h重復(fù)上述操作，求得峰面積RSD為1.9%，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

吸取已知濃度的供試品溶液500 μL，加入0.80 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL，混勻，進(jìn)樣10 μL，平行測定3次，求得熊果酸平均回收率為98.08%。

稱取已知濃度的同一樣品6份，依次分別制得樣品溶液，精密吸取樣品溶液10 μL，進(jìn)樣，求得峰面積RSD為1.9%。

3 ?結(jié)論

鎖陽中熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8），其回歸方程為y=622.7x-85.517，r=0.999 8。精密度RSD為1.39%，加樣回收率平均為98.08%，RSD為1.9%。熊果酸提取的最佳工藝條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W，鎖陽中熊果酸的含量約為1.53%。該方法提取鎖陽中的熊果酸含量較高，可為開發(fā)利用相關(guān)藥材提供參考。

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[19] 邱 ?震，周家才.薄層掃描法測定左歸丸中熊果酸含量[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（8）：698-699.endprint

1.3.3 ?熊果酸的提取與分析 ?稱取5 g鎖陽粉末樣品（粉碎機(jī)粉碎，過40目篩），按照1∶40（m/V，下同）加入氯仿回流3 h脫脂，回收溶劑，殘?jiān)鼡]干。用85%乙醇（V/V，下同）按20∶1液固比浸泡殘?jiān)?4 h后，超聲波提取45 min，離心得提取液，濾渣重復(fù)提取1次，合并提取液減壓濃縮，取出殘留液，甲醇定容至25 mL。取樣品過0.45 μm微孔濾膜后，在上述色譜條件下測定熊果酸的含量

1.3.4 ?鎖陽中熊果酸提取的單因素試驗(yàn) ?①乙醇體積分?jǐn)?shù)。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，按照料液比1∶20準(zhǔn)確加入70%～95%乙醇溶液，超聲功率150 W，超聲45 min后，參照“1.3.1”和“1.3.3”分析;②料液比。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，按不同料液比（1∶5～1∶30）加入85%乙醇溶液，超聲功率150 W，超聲時(shí)間45 min，后續(xù)步驟同①;③超聲時(shí)間。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，料液比1∶20，乙醇濃度85%，超聲功率150 W，選取超聲波輔助提取的時(shí)間為10～60 min，離心取上清液，后續(xù)步驟同①;④超聲功率。稱取1 g脫脂鎖陽樣品，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，料液比1∶20，超聲時(shí)間40 min，超聲波功率選擇50～300 W，后續(xù)步驟同①。

1.3.5 ?正交試驗(yàn) ?在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮多因素相互作用對鎖陽熊果酸提取的影響，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?色譜分析結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品提取液中熊果酸色譜圖分別見圖1和圖2。在該條件下，熊果酸可有效分離。

2.2 ?單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3～圖6。

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，熊果酸含量最大;隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，含量呈下降趨勢。主要原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)導(dǎo)致過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭，導(dǎo)致提取的熊果酸含量下降。

由圖4可知，隨著料液比增大，熊果酸含量逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，熊果酸含量最大;隨著料液比增大，熊果酸含量呈下降趨勢。主要原因是隨著料液比增大，鎖陽中其他成分溶解的幾率增大，同時(shí)延長了后續(xù)的濃縮過程，造成熊果酸的損失。

由圖5可知，當(dāng)超聲40 min時(shí)，熊果酸含量最大。隨著超聲時(shí)間的延長，過多的醇溶物質(zhì)與熊果酸競爭，影響了熊果酸的提取率，造成含量下降。

由圖6可知，超聲功率為150 W時(shí)，熊果酸含量達(dá)到最大;但過強(qiáng)的超聲波機(jī)械剪切力，破壞了熊果酸的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熊果酸含量下降。

2.3 ?正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率的4因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2極差分析可知，影響熊果酸提取效率的主次因素分別為料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、超聲時(shí)間。最佳提取工藝為A2B3C1D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W，在此組合下，獲得樣品中的熊果酸可達(dá)1.53%。

2.4 方法評價(jià)

吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得峰面積RSD為1.39%，表明儀器精密度良好。

吸取標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，進(jìn)樣，分別于0～6 h，每間隔0.5 h重復(fù)上述操作，求得峰面積RSD為1.9%，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

吸取已知濃度的供試品溶液500 μL，加入0.80 mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液500 μL，混勻，進(jìn)樣10 μL，平行測定3次，求得熊果酸平均回收率為98.08%。

稱取已知濃度的同一樣品6份，依次分別制得樣品溶液，精密吸取樣品溶液10 μL，進(jìn)樣，求得峰面積RSD為1.9%。

3 ?結(jié)論

鎖陽中熊果酸在4.0～16.0 μg/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8），其回歸方程為y=622.7x-85.517，r=0.999 8。精密度RSD為1.39%，加樣回收率平均為98.08%，RSD為1.9%。熊果酸提取的最佳工藝條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%、料液比1∶25、超聲時(shí)間30 min、超聲功率150 W，鎖陽中熊果酸的含量約為1.53%。該方法提取鎖陽中的熊果酸含量較高，可為開發(fā)利用相關(guān)藥材提供參考。

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